论文部分内容阅读
目的:本实验通过成功建立D-半乳糖衰老动物模型,并在建模前和建模过程中对大鼠进行中等负荷有氧运动,探讨不同时期有氧运动对衰老大鼠海马突触可塑性、磷酸二酯酶-4(Phos-phodiesterase 4,PDE-4)基因表达及DNA甲基化水平的影响,分析这些指标变化之间的相互关系及可能作用机制,探寻延缓脑衰老的最佳运动干预时期,为进一步揭示有氧运动延缓脑衰老提供理论依据和实验资料。方法:成年3月龄雄性SPF级SD大鼠,共60只,体重400±20g。大鼠购进后先适应性喂养一周,然后随机分为4组(n=15):对照组(C组)、衰老模型组(A组)、建模前运动组(E1组)、建模中运动组(E2组)。除C组外,其余三组大鼠均采用“腹腔注射D-半乳糖法”建立亚急性衰老动物模型。E1组、E2组分别在建模前、建模过程中进行中等负荷的游泳运动干预。动物实验结束后断头处死,迅速剥离海马并投入液氮保存备用。观察并记录大鼠一般状态,包括体重、进食及饮水量、精神状态、活动情况、体毛等变化;尼氏染色观察大鼠海马齿状回(dentate gyrus,DG区)神经元形态结构变化;免疫荧光检测大鼠海马DG区突触素(synaptophysin,Syp)、代谢型谷氨酸受体1(metabotropi glutamate receptor 1,mGluR1)的数量和密度的变化;Real-time PCR及Western Blotting检测大鼠海马PDE-4 mRNA及蛋白的表达;MassArray甲基化检测大鼠海马PDE-4基因甲基化水平。利用激光共聚焦扫描显微镜进行图像采集和分析;应用SPSS19.0统计学软件对实验所得数据进行统计处理。结果:(1)大鼠一般状态:C组大鼠精神状态良好,动作敏捷,饮食正常,体毛均匀而有光泽,体形健壮;A组大鼠出现精神不振,嗜睡,饮食量减少,动作迟缓,毛发枯黄卷曲,甚至脱落等衰老体征;E2组大鼠状态与C组相似;E1组稍差于E2组。大鼠体重前四周各组均稳定增长,无显著性差异(P>0.05);从第五周开始,除C组外,其余各组增长速度均不同程度减慢;第十周末大鼠体重变化趋势为C组>E2组>E1组>A组。(2)尼氏染色结果:C组大鼠海马神经元排列整齐,细胞核呈椭圆形,胞体和树突中尼氏体着色均匀,细胞结构完整;A组排列紊乱,数量明显减少,细胞间距增大,细胞核固缩,部分神经元细胞核模糊不清,胞体和树突中尼氏体着色变浅,细胞结构不完整;E1组、E2组情况分别与A组、C组接近。(3)免疫荧光染色结果:Syp的IOD值:A组和E1组均非常显著性低于C组(P<0.01),E1组显著高于A组(P<0.05),E2组非常显著性高于A组、E1组(P<0.01);mGluR1的IOD值:A组非常显著性低于C组(P<0.01),E1组显著性低于C组(P<0.05),且显著高于A组(P<0.05),E2组非常显著性高于A组、E1组(P<0.01);(4)大鼠海马PDE-4 mRNA及蛋白表达结果:与C组相比,A组非常显著性增高(P<0.01);E2组非常显著性低于A组和E1组(P<0.01)。(5)甲基化检测结果:5个位点甲基化水平各不相同,但各个位点之间变化趋势大致相同,C组、E2组均具有相对较高的甲基化水平,A组、E1组甲基化水平相对较低。(6)相关性分析结果:Syp的IOD值与PDE-4 mRNA呈非常显著性负相关(P<0.01),与PDE-4蛋白表达呈显著性负相关(P<0.05);mGluR1的IOD值与PDE-4 mRNA及蛋白表达均呈非常显著性负相关(P<0.05)。151和225位点的甲基化水平与PDE-4 mRNA及蛋白表达均呈非常显著性负相关(P<0.01);结论:(1)有氧运动可修复海马神经元的形态结构,使Syp和mGluR1数量和密度保持在一定的水平上,以维持突触可塑性的能力,改善脑功能,延缓脑衰老;(2)有氧运动可使PDE-4基因发生高甲基化,进而使该基因失活,通过下调其mRNA和蛋白的表达,降低该基因对下游通路的抑制作用。推测这可能是有氧运动修复海马神经元的形态结构、维持突触可塑性能力、改善脑功能、延缓脑衰老的可能机制之一;(3)不同时期有运动对脑衰老的干预效果不同,衰老过程中进行的有氧运动干预效果相对较好,提示:有氧运动需要持续才能更好地发挥其作用。