研究背景及目的原发性肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是第五大常发恶性肿瘤,全球癌症病人中HCC病人约占6%,且全球每年约有50万新增病例。在中国,HCC是第二大癌症杀手。目前,影像学如CT扫描、超声波检测或磁共振成像等是诊断HCC的主要手段,但是,影像学检测对微小病灶、良性病变或肝硬化结节等的鉴别准确度不够,对HCC的诊断临床仍缺乏可靠的方法。肿瘤标志物对肿瘤的诊断具有特异性,因此,临床需要特异的HCC标志物来辅助鉴别诊断HCC。甲胎蛋白(α-fetoprotein,AFP)是目前应用最广泛的HCC标志物,但约有11%-47%肝硬化病人、15%-58%慢性肝病病人或肝脏损伤修复患者其AFP值同样有显著升高。因此,临床仍需要特异的肝癌标志物为肝癌的早期发现及预后判断等提供信息。磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(glypican-3,GPC3)是通过糖基化磷脂酰肌醇连接在细胞膜上的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖家族中的一员。GPC3在胚胎组织如胎肝中有高表达,而在成人正常肝组织中不表达。目前,有大量研究表明,GPC3在HCC患者的癌组织和血液中都有高表达,在正常人和其他良性肝病患者中不表达。因此,GPC3被认为是具有潜力的肝癌标志物。但是,目前没有针对GPC3的检测试剂能应用到临床。因此,研发出GPC3的检测试剂显得尤为重要,这也是该标志物能服务于临床和病人所必须解决的问题。化学发光免疫分析(chemiluminescence immunoassay,CLIA)是将具有高灵敏度的化学发光测定技术与高特异性的免疫反应相结合,用于各种抗原、半抗原、抗体、激素、酶、脂肪酸、维生素和药物等的检测分析技术。是继放免分析、酶免分析、荧光免疫分析和时间分辨荧光免疫分析之后发展起来的一项最新免疫测定技术,可快速进行定量检测。其与传统的免疫检测相比,该技术具有灵敏度高,无放射性和致畸物质,背景低,反应时间短,性质稳定,操作简便,易于自动化,应用范围广,价格低廉等优点。相对于酶免分析、放射免疫分析等有更高的临床应用价值。在市场上已得到广泛应用。因此,我们研发了磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3定量测定试剂盒(化学发光免疫分析法)。方法:(一)磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3化学发光免疫分析定量测定试剂的工艺优化1.采用双抗体夹心两步法研制GPC3化学发光免疫定量分析试剂盒2.磁微球包被抗体的制备:将1.5mg抗体加入超滤离心管(50KD)中,8000r/min离心5-6min。按此条件用抗体包被缓冲液重复离心5-6次后,收集离心管内滤液。取120mg磁微球加入反应瓶中,在磁力架上用包被缓冲液反复清洗磁微球5次,加入活化缓冲液活化悬浮磁微球30分钟;再用抗体包被缓冲液在磁力架上清洗磁微球5次。将离心好的抗体加入活化好的磁微球中,室温下反应12小时。向包被好的磁微球中加入1.2ml的封闭液,室温旋转封闭4小时。3.吖啶酯标记抗体的制备:将0.5mg抗体加入超滤离心管(50KD)中,8000 r/min离心5-6min进行浓缩。按此条件用抗体包被缓冲液重复离心5-6次后。向处理好的抗体里加入5ul的吖啶酯溶液,室温下振荡6小时。用SephadexTM G-50 Medium纯化去除游离的吖啶酯。4.用GPC3抗原制备标准品、试剂盒校准品及质控品1)标准品:A:0 ng/ml;B:1.0ng/ml;C:2.5ng/ml;D:10.0ng/ml;E:50.0ng/ml;F:200.0ng/ml。2)校准品:校准品1:1.0ng/ml;校准品2:50.0ng/ml。3)质控品:C1:5.0ng/ml;C2:15.0ng/ml;C3:60.0ng/ml5.反应条件优化:对标准品加样体积(40μL、60μL、80μL、100ul)、反应温度(25℃、30℃、37℃)的优化。(二)磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3化学发光免疫分析定量测定试剂的分析性能评价1.最低检测限:用零浓度标准品作为样本进行检测,重复测定20次,得出20次测量结果的RLU值,计算其平均值(M)和标准差(SD),得出M+2SD,根据标准曲线进行拟合得出一次方程,将M+2SD的发光值代入上述方程中,求出对应的浓度值,即为最低检测限。2.准确度:将GPC3抗原用标准品稀释液进行一系列稀释,将其作为样本用自制的三批试剂盒分别进行测定。系列稀释的GPC3抗原的实测效价与标示效价的比应在0.900～1.100范围内。3.剂量-反应曲线的线性:试剂盒检测范围为1.0ng/ml～200.0ng/ml,用标准品,将每一浓度样本重复检测3次,计算其平均值,通过四参数数学模型拟合线性,并计算线性相关系数r.4.重复性:用低值、中值和高值质控品作为样本各重复检测10次,计算10次测量结果的平均值M和标准差SD,根据公式CV=SD/M×100%得出其变异系数(CV)。5.质控品测定值:用低值、中值和高值质控品作为样本各重复检测10次,计算10次测量结果的平均值M。低值质控品范围在3.5～6.5ng/ml;中值质控品范围在10.5～19.5ng/ml;高值质控品范围在42.0～78ng/ml。6.批间差:用3个不同批号试剂盒检测中值质控品,各重复检测10次,计算30次测量结果的平均值M和标准差SD,根据公式CV=SD/M×1 00%得出其变异系数(CV)。7.分析特异性:将AFP、CEA、CA19-9、HBsAg、HBeAg这5种抗原用标准品稀释液稀释至200.0ng/ml,用三个批次的试剂盒按试剂盒操作步骤对这五种特异性抗原进行检测。8.抗干扰性:将甘油三酯、胆红素、血红蛋白按不同的浓度分别加入GPC3质控品中,用三个批次的试剂盒按试剂盒操作步骤对质控品进行检测,计算各质控品的检测值的均数。9.HOOK效应:将GPC3抗原用标准品稀释液稀释成以下浓度:0ng/ml、1ng/ml、2.5ng/ml、10ng/ml、50ng/ml、200ng/ml、400ng/ml、600ng/ml、800ng/ml、1000ng/ml、1200ng/ml、1400ng/ml、1600ng/ml、1800ng/ml、2000ng/ml。在试剂盒中进行检测,通过四参数拟合线性。10.稳定性:分别进行效期稳定性(2～8℃冰箱0个月、3个月、6个月、9个月、12个月、14个月、16个月)、热稳定性(37℃烘箱0天、3天、7天)、开瓶稳定性(2～8℃内开瓶放置0天、10天、20天、30天、40天、50天)、运输稳定性(模拟运输条件4天)。(三)试剂盒临床性能评估1.参考值的确定:以自制的(GPC3)定量测定试剂盒(化学发光免疫分析法)检测362份健康人血清,101份乙型肝炎(大三阳)患者血清及100份肝硬化患者血清,统计检测得到的GPC3浓度值的97%百分位数分布。根据分布的百分比,初步确定GPC3正常人参考值;检测53份肝癌患者血清,将非肝癌患者血清测值与肝癌患者血清测值进行ROC曲线拟合,再综合ROC曲线及其他文献研究资料,最终确定血清GPC3参考值。2.肝癌患者术前术后血清的检测:分别用磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3定量测定试剂盒(化学发光免疫分析法)和甲胎蛋白定量测定试剂盒(时间分辨免疫荧光法)检测收集的32例肝癌患者术前术后血清。结果:(一)磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3化学发光免疫分析定量测定试剂的工艺优化1.采用双抗体夹心两步法进行检测,其结果较一步法发光值高,线性达到0.9999。2.磁微球按12.5μg/mg包被浓度在室温(18-25℃)下震荡12h后用封闭液3#封闭4h,在包被保存液2#中保存,其检测结果达到最佳;3.吖啶酯按10:1比例在室温(18-25℃)下孵育6h,纯化后用标记稀释液2#保存,其反应的本底低,线性相关系数好。4.80μL加样体积具有足够高的发光值,且线性相关系数好,故选择80μL加样体积。37℃的发光值最高,且本底仍然保持较低水平,因此选定37℃为反应的温度。(二)磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3化学发光免疫分析定量测定试剂的分析性能评价1.计算得出试剂盒的最低检出量为0.1ng/ml。2.系列稀释的GPC3抗原实测浓度与标示浓度的比值在0.968～1.080之间,符合标准品准确性评价要求。3.线性范围内,剂量-反应曲线线性相关系数,r在0.9995～0.9999之间。4.试剂盒重复性CV在4.76%～5.42%之间。5.质控品测定值均在允许范围内。6.三批试剂盒的批间差为6.41%。7.检测AFP(200ng/ml)、CEA(200ng/ml)、CA19-9(200ng/ml)、HBsAg(200ng/ml)及 HBeAg(200ng/ml)均不高于 0.1ng/ml。8.三批试剂盒均不受甘油三酯(5%)、胆红素(0.32mg/ml)、血红蛋白(18mg/ml)的干扰。9.检测浓度达到2000ng/ml时,仍未出现HOOK效应。10.试剂盒在2～8℃放置12个月、37℃放置7天、2～8℃开瓶放置30天、模拟运输条件下密封后4天(96小时),各项性能指标均符合要求,稳定性较好。(三)试剂盒临床性能评估1.362例健康人血清,当浓度值在1.5578ng/ml时,包含了 97.5%的样本;101例乙型肝炎和100例肝硬化患者血清,当浓度值在2.1035ng/ml时,包含了97.5%的样本;将362例健康人、101例乙型肝炎、100例肝硬化及53例肝癌患者血清GPC3检测结果做ROC曲线,结果显示,当GPC3参考值在2.2150 ng/ml时,灵敏度为35.8%,特异性为99.1%。因此,本试剂盒以<2.2ng/ml为参考范围。2.32例术前术后患者血清,术前GPC3阳性率为34.38%(11/32),AFP阳性率为43.75%(14/32),其联合检测阳性率为59.38%(19/32)。阳性样本的术后GPC3或AFP测值均呈现下降趋势,GPC3测值平均下降27.65%,AFP测值平均下降17.50%。结论:上述结果表明本研究研制的GPC3化学发光免疫定量分析试剂的各项指标(最低检测限、准确性、剂量-反应曲线线性、重复性、质控品测定值、批间差、分析特异性、抗干扰性、HOOK效应、稳定性等)均能够满足临床检测试剂要求,有望经进一步优化后应用于生产。