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第一部分小续命汤对急性脑缺血再灌注损伤的总体作用及对血脑屏障的保护作用研究目的：通过建立脑缺血再灌注损伤模型,探讨小续命汤对急性脑缺血再灌注损伤的总体作用及对血脑屏障的保护作用。方法：将120只SPF级雄性Sprague-Dawley (SD)大鼠随机分为5组,分别为假手术组(Sham),脑缺血再灌注组(IR),脑缺血再灌注+小续命汤低剂量组(15g/kg/day)(XXMD15),脑缺血再灌注+小续命汤中剂量组(30 g/kg/day)(XXMD30),脑缺血再灌注+小续命汤高剂量组(60 g/kg/day)(XXMD60)。采用左侧大脑中动脉阻塞(Middle cerebral artery occlusion, MCAO)法建立局灶性脑缺血再灌注损伤模型。脑缺血再灌注24 h后进行2,3,5-triphenyltetrazolium chloride(TTC)染色,根据TTC染色计算脑梗死面积及半球肿胀；实验各组脑缺血病理性损害通过再灌注24h后hematoxylin-eosin (HE)染色进行评估；于不同时间点观察各组大鼠的行为学改变：再灌注24 h后透射电镜观察血脑屏障亚显微结构的变化。通过测定脑含水量、伊文思蓝渗出量评估脑水肿形成及血脑屏障通透性改变。免疫组织化学染色、western blot检测急性脑缺血再灌注后MMP-9, MMP-2及VEGF的表达变化。结果：与脑缺血再灌注模型组比较,小续命汤中、高剂量(30/60 g/kg/day)治疗可显著缩小急性脑缺血再灌注导致的脑梗死面积和半球肿胀,明显减轻缺血性病理改变,显著改善模型动物的行为学表现。小续命汤(60 g/kg/day)治疗可明显减少脑含水量、伊文思蓝渗出量,保护血脑屏障的亚显微结构。另外我们还发现小续命汤(60 g/kg/day)治疗可显著下调脑缺血再灌注后MMP-9, MMP-2及VEGF的表达。结论：小续命汤对急性脑缺血再灌注损伤有一定的神经保护作用,60 g/kg/day是小续命汤治疗急性脑缺血再灌注损伤的最佳疗效剂量。小续命汤(60 g/kg/day)可从结构、功能上减轻脑缺血再灌注损伤导致的血脑屏障破坏,可能与下调MMP-9, MMP-2及VEGF的表达有关。第二部分小续命汤对急性脑缺血再灌注神经血管单元的保护作用及机制研究目的：通过建立脑缺血再灌注损伤动物模型,探讨小续命汤对急性脑缺血再灌注神经血管单元的保护作用及相关机制。方法：将106只SPF级雄性SD大鼠随机分为5组,分别为假手术组(Sham)、脑缺血再灌注模型组(I/R)、脑缺血再灌注+小续命汤治疗组(60 g/kg/day)(XXMD60),脑缺血再灌注+小续命汤治疗+LY294002组(XXMD60+LY294002),脑缺血再灌注+小续命汤治疗+Vehicle组(XXMD60+Vehicle)。小续命汤治疗组术前3 d开始连续灌胃给予相应体积的小续命汤至观察时间节点。采用左侧大脑中动脉线栓法建立脑缺血再灌注损伤模型。XXMD60+LY294002、XXMD60+Vehicle组在脑缺血诱导前30 min侧脑室给予10μl 10mM LY294002或Vehicle。脑缺血90 min再灌注24h后进行神经功能缺损评分,TTC染色评价实验各组脑梗死面积。再灌注24h后Nissl染色评估实验各组缺血皮层半暗带区的完整细胞数。再灌注24 h后TUNEL染色联合免疫荧光法标记不同的细胞标记物(NeuN、GFAP、CD31)以检测实验各组缺血皮层半暗带区神经元、星形胶质细胞、血管内皮细胞的凋亡情况。Western blot检测各组急性脑缺血再灌注后PI3K/Akt通路相关蛋白的表达。结果：与脑缺血再灌注模型组比较,小续命汤(60 g/kg/day)可显著促进急性脑缺血再灌注大鼠的神经功能恢复,减少脑梗死面积,促进缺血半暗带区细胞的存活,而PI3K抑制剂可阻断小续命汤的保护作用。TUNEL及免疫荧光结果提示小续命汤可显著减少神经血管单元多种类型细胞凋亡,PI3K抑制剂可阻断小续命汤的多靶点抗凋亡作用。Western blot结果显示小续命汤显著上调p-PDK1(Ser241), p-PTEN(Ser380), p-Akt (Ser473), p-GSK3β(Ser9)及p-c-Raf(Ser259)蛋白的表达,PI3K抑制剂与小续命汤联用时可破坏小续命汤对p-PDK1(Ser241), p-Akt (Ser473), p-GSK3p(Ser9)蛋白表达的影响,而不能阻断p-PTEN(Ser380), p-c-Raf(Ser259)蛋白的表达上调。结论：小续命汤治疗(60 g/kg/day)可抑制急性脑缺血再灌注导致的神经血管单元多种类型细胞凋亡,该保护作用可能与激活的PI3K/Akt信号通路相关。第三部分小续命汤对急性脑缺血再灌注线粒体的保护作用及机制研究目的：本部分研究旨在通过建立脑缺血再灌注损伤动物模型,探讨小续命汤对急性脑缺血再灌注线粒体的保护作用及相关机制。方法：将85只SPF级雄性SD大鼠随机分为假手术组(Sham)、脑缺血再灌注组(I/R)、脑缺血再灌注+小续命汤治疗组(60g/kg/day)(XXMD60),共三组。小续命汤治疗组从术前3d开始连续灌胃给予相应体积的小续命汤至实验结束,而假手术组及脑缺血再灌注组给予相应体积的双蒸水。脑缺血再灌注损伤由左侧大脑中动脉线栓法诱导。脑缺血再灌注24 h后透射电镜观察急性脑缺血再灌注后实验各组线粒体的形态改变。再灌注24 h后TUNEL染色联合cleaved caspase 3免疫组织化学染色检测脑缺血皮层半暗带区的细胞凋亡。将新鲜脑组织分离提取线粒体蛋白、胞浆蛋白部分,首先进行纯化验证,免疫荧光染色联合western blot观察急性脑缺血再灌注后p53蛋白在线粒体的表达及p53蛋白的线粒体转位,并用estern blot检测急性脑缺血再灌注后线粒体p53通路相关蛋白的表达。结果：小续命汤治疗(60 g/kg/day)可明显减轻急性脑缺血再灌注导致的线粒体形态改变。与模型组比较,小续命汤可显著抑制缺血皮层半暗带区神经细胞凋亡。另外,小续命汤可显著下调p53蛋白在线粒体的表达,减少p53蛋白的线粒体转位及线粒体Bax蛋白表达水平,上调线粒体部分Bcl-2蛋白的表达,减少cytochrome c, Smac/Diablo蛋白从线粒体的释放,抑制胞浆部分caspase 9, caspase 3的活化,并上调c-IAP1的表达。结论：小续命汤治疗(60 g/kg/day)可明显保护急性脑缺血再灌注后线粒体的形态,抑制细胞凋亡,减少线粒体p53表达和p53线粒体转位,其作用机制可能与线粒体p53通路的激活有关。