论文部分内容阅读
目的:骨关节炎（Osteoarthritis,OA）是一种常见的致残性疾病,疾病常累及整个关节,包括关节软骨、滑膜、囊膜、软骨下骨、韧带及关节周围肌肉的结构改变。软骨是一种高度特化的结缔组织,关节软骨损伤和退变是OA的主要特征。膝关节是骨关节炎最常见的部位。由于人口老龄化和肥胖人口的日益增加,这一综合症变得愈加普遍,目前全球有超过2.5亿人受到影响。疼痛和残疾是骨关节炎的主要表现。目前治疗OA的手段有多种,如关节置换术、口服非甾体抗炎药、关节腔内注射皮质类固醇等,但其目的多局限于缓解症状且医疗成本较高,某些药物对心血管和胃肠道等其他组织器官的副作用仍不容忽视。因此寻找一种新的治疗措施迫在眉睫。骨关节炎的发病机制复杂,涉及炎症、机械负荷、衰老和代谢等因素,最终导致整个关节结构破坏。文献报道OA与内质网应激（ER Stress,ERS）相关,其中肌醇依赖性激酶1α/X-盒结合蛋白-1（IRE1α/XBP1）途径可以促进ERS下异常蛋白的降解和再折叠,维持内质网环境的稳定,促进正常的软骨细胞功能。本研究以IRE1α/ERN1为切入点,运用ERN1 cKO软骨特异性敲除小鼠、关节腔注射等方法,探讨IRE1α/ERN1在OA软骨损伤及OA发生中的作用机制,为OA的治疗、软骨损伤及修复提供新的见解。方法:1.ERN1软骨特异性敲除小鼠繁殖与鉴定。首先我们通过将ERN1flox/flox小鼠与Col2-Cre启动子小鼠进行杂交,利用Cre/Lox P系统成功繁殖得到ERN1软骨特异性敲除小鼠（ERN1 cKO）和对照小鼠ERN1flox/flox（Control）。2.ERN1 cKO老龄鼠自发OA表型分析。收集12月龄的ERN1 cKO和Control小鼠的膝关节标本;通过番红固绿和H＆E染色评估关节软骨的损伤情况;采用免疫组化（IHC）检测软骨合成代谢、分解代谢标志物的表达;运用qPCR检测成骨相关标志物的mRNA水平;步态分析观察小鼠步态数据,评估疼痛相关指标。3.ERN1 cKO小鼠在ACLT手术诱导OA模型中的表型分析。在WT小鼠建立ACLT诱导的OA模型。通过IHC和Western blot检测ERS标志物的表达;在ERN1 cKO和Control小鼠构建ACLT模型,收取不同时间点的膝关节样本;通过番红固绿染色、OARSI评分、免疫荧光（IF）和qPCR等实验评估软骨损伤程度、软骨合成代谢和软骨分解代谢标志物的表达。4.筛选IRE1α的结合蛋白并分析其与IRE1α结合对OA软骨损伤作用的影响。蛋白质组学筛选IRE1α富集的潜在蛋白,并通过VMD预测,IF和免疫共沉淀（Co-IP）验证。通过过表达ERN1和敲低IRE1α结合蛋白干预ACLT诱导的OA模型。采用qPCR、番红固绿染色、IHC进行相应指标的分析。5.筛选得到IRE1α结合蛋白对XBP1s剪接及XBP1功能的实验研究。CRISPR-Cas9构建IRE1α结合蛋白敲除细胞,检测其对IRE1α剪接XBP1u产生XBP1s的影响;将过表达XBP1s腺病毒（Ad XBP1s）与IRE1α结合蛋白的重组蛋白联合注射到ACLT诱导的OA模型关节腔内,检测其对XBP1功能的影响,检测其对XBP1功能的影响。6.IRE1α通过XBP1s调控Col2表达和影响胶原稳态的实验研究。ERS条件下,采用Western blot和IF检测IRE1α结合蛋白对剪接型XBP1s功能产生的影响;运用RNA-seq筛选XBP1 cKO小鼠软骨和WT小鼠的差异基因;JASPAR网站预测转录因子XBP1s结合位点,染色质免疫共沉淀（CHIP）、双荧光素酶报告基因实验和关节腔内局部注射过表达XBP1s腺病毒验证;Western blot检测ERN1缺陷原代软骨细胞中XBP1s和Col2的表达;ERN1缺陷小鼠经ACLT手术诱导OA模型,检测软骨硫酸盐粘多糖（sGAG）的含量;透射电镜（TEM）和扫描电镜（SEM）观察ERN1 cKO对小鼠软骨细胞和胶原的超微结构的改变。结果:1.ERN1 cKO软骨特异性敲除老龄鼠表现出自发OA样表型。ERN1 cKO老龄鼠软骨蛋白多糖丢失严重,OARSI评分升高,成骨相关标志物mRNA表达水平上调,软骨合成代谢减少、分解代谢增加,小鼠步态异常,疼痛加重。2.ERN1软骨缺陷加重小鼠ACLT模型OA进展。IRE1α和p-IRE1α在OA患者和ACLT诱导的小鼠OA模型中高表达。ERN1 cKO小鼠在ACLT术后出现更严重的关节软骨损伤,ERN1缺陷上调ACLT术后的软骨分解代谢、抑制软骨合成代谢。3.PGRN结合IRE1α并调控IRE1α对OA关节软骨的保护作用。过表达ERN1增加了软骨合成代谢、降低软骨分解代谢,关节腔局部注射过表达ERN1缓解了ACLT诱导的OA软骨损伤;IRE1αKinase结构域与PGRN结合;过表达ERN1促进PGRN的表达,反之抑制PGRN的表达。敲低PGRN抑制ERN1对OA关节软骨的保护作用。4.IRE1α剪接XBP1s依赖于PGRN且PGRN通过ERK信号通路促进XBP1s的软骨保护作用。XBP1s的过表达上调PGRN表达,利用siRNA靶向敲低XBP1s则抑制PGRN的表达;PGRN缺陷抑制XBP1u/s表达,IRE1α无法正常剪接XBP1u产生XBP1s;PGRN通过ERK信号通路促进XBP1s的软骨保护作用。5.IRE1α通过XBP1s上调Ⅱ胶原蛋白表达影响胶原稳态。siPGRN抑制过表达ERN1对XBP1s的核转位;RNA-seq在XBP1 cKO小鼠和WT小鼠软骨中筛选出多个与胶原相关的差异表达基因和GRN/PGRN;JASPAR预测XBP1s转录因子结合Col2基因启动子区的结合位点,CHIP、双荧光素酶实验和IHC验证XBP1s结合Col2启动子并上调Col2的转录和表达。电镜观察ERN1缺陷导致软骨细胞结构破坏、胶原断裂紊乱。结论:本研究运用ERN1软骨特异性敲除小鼠模型,同时联合临床OA患者样本证明了IRE1α/ERN1在OA发生发展中的重要作用。ERN1cKO老龄鼠表现出自发OA样表型;同时在ACLT OA模型中加速软骨损伤和OA进展;关节腔注射Ad ERN1可减轻ACLT WT模型小鼠软骨基质的降解并阻止OA进展,进一步阐明IRE1α这一保护OA关节软骨损伤的作用依赖于分子伴侣PGRN,及磷酸化IRE1α介导XBP1mRNA剪接产生的转录因子XBP1s;XBP1s,一方面,通过TNF-α/ERK1/2信号通路保护关节软骨,另一方面,通过调节Col Ⅱ表达维持胶原蛋白稳态。该研究从内质网应激、UPR角度全新的阐释了OA发病机制,阐明IRE1α可能作为治疗OA及其他关节退行性疾病的治疗靶点,为后续临床研究奠定基础。