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目的:摸索运用末端转移法、原位末端标记法及琼脂糖电泳法研究机体死后不同时间段DNA的降解程度及规律,探讨该规律在推断死亡时间方面的可行性,为实际工作中推断死亡时间提供一个科学的依据。
方法:取SD大白鼠,颈椎错位处死,置于室温20℃的环境下,在死后不同时间段(0h、1h、2h、4h、6h、8h、10h、12h、14h、24h、36h及48h)取材,所取检材为肝、肾、脾,按照取材死后时间段的不同分为12组。课题共分三个部分:第一部分:运用末端转移法检测DNA降解:剪碎组织,酚氯仿提取组织DNA;紫外可见分光光度计在260nm、280nm波长处检测DNA提取液的吸光度值,获得DNA的纯度和浓度;每个死亡时间段均取1ug DNA,加入5U TdT酶、5nmoldUTP,在37℃水浴中相互反应1h;用无水乙醇和乙酸铵共沉淀DNA,保留液体:紫外可见分光光度计在260nm波长处检测液体中反应剩余的dUTP的吸光度。第二部分:运用原位末端标记法检测DNA降解:组织用10%中性多聚甲醛固定;常规脱水、透明、石蜡包埋,切片;组织印片制作,甲醛固定;用细胞凋亡检测试剂盒检测,步骤按照试剂盒说明书;脱水、透明、中性树酯封片;显微镜下观察,拍照,图像分析。第三部分:酶切琼脂糖电泳检测DNA降解:取1ug DNA加2U MluI酶,酶切后琼脂糖电泳,溴化乙锭染色,观察结果。
结论:机体死后组织细胞DNA随死亡时间延长而不断降解,并具有一定的规律性。末端转移法与原位末端标记法都具有敏感性强、易操作等优点,综合运用,可更为准确、可靠的推断死亡时间,特别是早期死亡时间的推断。在DNA酶切琼脂糖电泳实验上,对早期死亡时间推断无实际使用价值,考虑在后期进一步研究中,延长检测DNA降解的死亡时间,可望观察到死后细胞DNA的降解规律。