骨的稳态是骨吸收与骨形成的一个动态平衡,而这一稳态主要由成骨细胞的成骨作用和破骨细胞的骨吸收作用来维持。成骨细胞作为骨形成的主要功能细胞,主要来源于骨膜和骨髓基质的间充质始祖细胞。分化成熟的成骨细胞位于骨的表面,产生粘多糖、糖蛋白胶原纤维和胶原等,促进细胞外骨基质矿化形成骨细胞。在骨重塑过程中,破骨细胞和成骨细胞间的相互作用发生在基本多细胞单位(basic multicellular unit),通过直接接触、分泌旁分泌因子及细胞与骨基质作用等方式进行相互调节,进而精确调控骨的重塑过程。在成骨细胞主要表现为分泌大量细胞因子(如Ⅰ型胶原、骨钙素等),刺激破骨细胞的形成分化及促进功能的改变,对破骨前体细胞的迁徙进行调节干预。破骨细胞是由骨髓中的髓系祖细胞分化而成的单核巨噬细胞相互融合形成,是一种多核巨细胞。成熟的破骨细胞主要行使骨的溶解吸收功能,同时亦有调控骨内血管形成、调控骨形成和骨钙素的激素作用等生物学作用。破骨细胞受骨保护素、RANK配体、甲状旁腺激素、降钙素、白细胞介素6等多种因子的影响和调节。破骨细胞形成分化需要核因子κB配体的受体活化因子配体(RANKL)和巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)的存在。这些膜结合蛋白是由邻近的基质细胞和成骨细胞产生的,其中M-CSF、RANKL直接参与破骨细胞的调控作用[1]。M-CSF属于一种造血生长因子,参与骨髓祖细胞、巨噬细胞和单核细胞的增殖、分化,也影响着破骨前体细胞的存活及增殖[2-4]。在甲状旁腺激素的内分泌刺激作用下,成骨细胞释放的M-CSF对破骨细胞产生旁分泌作用[5]。M-CSF可与单核巨噬细胞上的相关受体结合,诱导其向破骨前体细胞增殖分化,并表达特异性核因子-κB受体活化因子(RANK),并最终导致骨溶解吸收(分解)。RANKL作为一种凋亡调节基因,是骨保护素(OPG)的结合配体,同时也是受体RANK的配体。在M-CSF的协同作用下,RANKL与其特异性受体RANK结合后,影响破骨细胞的分化形成,同时也影响了其骨溶解作用的发挥。动物实验表明将小鼠中相关目的基因靶向敲除会导致破骨细胞缺乏和严重的骨硬化症[6];且在妊娠期间,RANK-RANKL信号通路参与调节破骨细胞的分化及活性能力,此通路在骨钙的释放调节中起关键作用,是影响骨吸收和骨矿化的关键介质。骨髓和成骨细胞中的RANKL的表达最为重要,对骨代谢起关键作用。破骨细胞活性是通过成骨细胞表面的RANKL结合激活破骨细胞的NF-κB的表面结合受体激活剂而触发的。RANKL的过度表达或活性增强与多种骨溶解性疾病有关,如由炎症(人工关节置换术后无菌性假体松动、类风湿性关节炎)、绝经后骨质疏松症和癌症引起的骨溶解性损伤(如肿瘤导致的骨质破坏、多发性骨髓瘤)等疾病,都表现为骨量明显丢失。基于RANKL介导的破骨细胞功能亢进与多种类型的病理性骨溶解的密切关系,且RANKL/RANK/OPG信号系统是RANKL参与骨重建的典型途径,因此通过抑制破骨细胞形成和活性以及骨的吸收是治疗破骨细胞相关骨溶解性疾病的合理选择,也有利于推动特异性靶向治疗的探索。随着中国中医药技术的发展,传统中药的单体或复方制剂逐渐应用于临床并取得良好效果。应用于抗骨质疏松症的中药单体也成为当前的研究热点之一。新芒果苷(7-O-D-glucopyranosyl-mangiferin)是一种中药的单体,由漆树科类植物芒果的果实、叶等提取,具有抗病毒、抗氧化、免疫调节、抗炎及抗肿瘤等药效。研究证实新芒果苷的化学活性较强,可用于防治糖尿病肾病[7],有防止血管内皮细胞损伤的作用[8]。但新芒果苷在防治破骨细胞相关性骨溶解疾病方面,未见有相关研究报道。本实验研究通过现代细胞分子生物学实验方法,观察新芒果苷对破骨细胞的形成、分化及骨溶解吸收能力的影响,并同时探讨其可能的分子水平机制。结合小鼠颅骨骨溶解模型及小鼠骨质疏松模型,进一步探讨新芒果苷在防治骨溶解疾病的作用及其机制。本实验设计为如下四个部分:第一部分新芒果苷对体外破骨细胞定向分化及骨吸收功能的影响目的:研究新芒果苷对体外诱导小鼠骨髓巨噬细胞向破骨细胞分化的影响。方法:提取8周龄C57BL/6小鼠骨髓细胞,应用贴壁法获得骨髓单核细胞(BMMs)。加入M-CSF和RANKL进行刺激诱导后,进行抗酒石酸酸性磷酸酶染色及骨溶解吸收能力的检测。通过MTS实验检测新芒果苷对破骨细胞前体细胞活性的影响。使用不同浓度新芒果苷干预BMMs向破骨细胞的分化,并应用TRAP染色检测;利用Real-time PCR技术测定破骨细胞相关特异性基因的表达水平;应用Western blot实验方法,检测新芒果苷对RANKL诱导的破骨细胞NF-κB和MAPK信号传导通路相关重要信号蛋白磷酸化水平的影响情况。结果:1、新芒果苷对破骨细胞的形成分化有抑制作用,呈剂量依赖性。2、MTS检测结果显示,新芒果苷对BMMs细胞活力无毒性作用。3、新芒果苷各药物组的破骨细胞数量及骨片上吸收陷窝的面积均小于对照组。4、Real-time PCR检测结果显示,应用新芒果苷组干预的破骨细胞中组织蛋白酶K(cathepsin K)、基质金属蛋白酶-9(Matrix Metallo Proteinase-9 MMP-9)及TRAP的m RNA表达水平降低。5、Western blot结果显示,新芒果苷可以抑制RANKL诱导破骨细胞内NF-κB信号通路及MAPK信号通路的相关蛋白质的磷酸化水平。结论:新芒果苷呈剂量依赖性地抑制RANKL诱导的破骨细胞形成及骨吸收,其机制可能与新芒果苷抑制NF-κB信号通路及MAPK信号通路的相关蛋白质的磷酸化水平有关。第二部分新芒果苷对卵巢切除所致骨溶解吸收的影响目的:观察新芒果苷对小鼠去卵巢所致骨溶解的抑制作用方法:选取C57BL/6雌性小鼠,建立小鼠骨质疏松模型(手术切除卵巢)并使用药物干预,应用Micro-CT对其胫骨进行扫描并分析,并进行病理学HE染色和TRAP染色进行分析。研究新芒果苷对切除卵巢所致的小鼠骨质疏松性骨溶解的影响作用。结果:新芒果苷组、雌激素组的骨小梁数目较模型对照组多。高剂量新芒果苷组小鼠的骨小梁数目较低剂量组有增加。新芒果苷可以明显减少OVX模型的骨丢失。新芒果苷可以明显地减少单位面积上骨小梁表面破骨细胞的数量。结论:新芒果苷对切除卵巢所致的小鼠骨质疏松性骨溶解的有明显的抑制作用。第三部分新芒果苷对UHMWPE磨损颗粒诱导小鼠骨溶解的影响目的研究新芒果苷对UHMWPE磨损颗粒诱导小鼠骨溶解的影响。方法:建立UHMWPE磨损颗粒诱导的颅骨骨溶解小鼠模型。分4组给予小鼠不同干预,取小鼠腹腔动脉血行酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测,检测破骨细胞相关受体(OSCAR)和小鼠I型胶原C端肽(CTX-1)的水平。分离颅骨行Micro-CT分析其骨溶解情况。然后行HE染色、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色观察颅骨溶解破坏情况。结果:新芒果苷可以抑制UHMWPE磨损颗粒诱导小鼠颅骨吸收溶解和以及抑制破骨细胞形成。ELISA检测发现在新芒果苷干预下破骨细胞生成标志物的表达水平降低;病理学检测分析提示新芒果苷能明显抑制炎症因子的水平。结论:新芒果苷具有抗炎作用,可以减轻假体周围骨溶解,可以抑制UHMWPE颗粒导致的巨噬细胞炎症反应。第四部分新芒果苷对成骨细胞分化和相关基因表达的影响目的:探讨新芒果苷对小鼠成骨细胞的分化和相关基因表达的影响。方法:提取健康C57BL/6小鼠的BMMs,并用成骨细胞诱导液培养基定向刺激成骨细胞的分化。加入不同浓度新芒果苷干预,测定贴壁细胞的ALP活性和矿化量。使用PCR技术检测成骨细胞相关基因的表达量。结果:使用碱性磷酸酶试剂盒检测发现各组贴壁细胞的ALP活性无差别。应用茜素红染色发现,对照组和新芒果苷处理组的矿化面积之间是相似的。RT-PCR的实验发现新芒果苷对不同时间点的OB相关基因的表达水平没有影响。结论:新芒果苷对小鼠成骨细胞的形成分化和矿化作用无影响。