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目的(1)对大鼠胰岛beta细胞中是否存在65kDa大小截短型P糖蛋白(mini-P糖蛋白)进行初步鉴定。(2)初步探究黄连素、环孢菌素A及阿霉素对大鼠胰岛beta细胞P糖蛋白表达的影响,从而为进一步研究P糖蛋白在胰岛素分泌中所起的调节作用提供依据。方法一、应用northern blottimg分析大鼠胰岛及INS-1细胞P糖蛋白mRNA的表达：(1)分离SD大鼠胰岛及培养INS-1细胞,分别提取组织/细胞总RNA。针对大鼠abcblb基因设计探针的引物序列,应用RT-PCR技术合成所需cDNA探针,纯化后应用罗氏地高辛标记与检测试剂盒(DIG DNA Labeling and Detection Kit, Roche)进行地高辛-dUTP标记,获得northern blotting检测探针。(2)大鼠胰岛及INS-1细胞RNA行甲醛变性凝胶电泳,经毛细管虹吸印迹法转移至尼龙膜上后120℃30min烘烤固定。(3)探针与胰岛及INS-1细胞RNA进行杂交。(4)应用罗氏试剂盒对杂交结果进行检测。二、应用western blotting在蛋白表达水平探究mini-P-糖蛋白的表达：(1)取6孔细胞培养板对数生长期的INS-1细胞,用裂解液按照蛋白提取试剂盒说明进行操作,分别在蛋白酶抑制剂“Protease Inhibitor Cocktail Tablets"(商品名：cOmplete ULTRA Tablets, Mini, EDTA-free, EASYpack Roche)和无蛋白酶抑制剂的条件下提取INS-1细胞蛋白。(2)BCA法测定蛋白浓度后行10%SDS-PAGE凝胶电泳分离目的蛋白,转膜、封闭、洗涤后用小鼠抗大鼠P糖蛋白特异性单克隆抗体C219(1：200)4℃孵育过夜,加HRP结合的山羊抗小鼠二抗(1：10000)室温孵育2h, TBST漂洗3次后ECL增强显色。三、 Real-Time PCR检测黄连素、环孢菌素A及阿霉素对abcbl基因表达的影响：分别应用黄连素(0.2μM,1μM,5μM,20μM),环孢菌素A (O.1μg/mL)及阿霉素(50ng/mL)对INS-1细胞干预一周,提取每组细胞的总RNA后经RT-PCR逆转录为cDNA,应用Real-time PCR技术分别检测P糖蛋白调控基因(abcbl、 abcbla与abcblb)及凋亡相关基因(Bcl-2与caspase-3)的表达情况。结果(1) Northern blotting结果显示单条带,分子量大小约3.0kb。(2) Western blotting结果显示无蛋白酶抑制剂组仅有65kDa的"mini-P-糖蛋白”的表达,而在蛋白酶抑制剂保护组主要表达分子量为170kDa大小的全长P糖蛋白且"mini-P-糖蛋白”表达显著减低。(3)黄连素0.2μM、1μM,5μM组abcbla-N表达增高,差异具有统计学意义(P＜0.05);环孢菌素A与50ng/mL阿霉素组所有基因表达差异均无统计学差异。结论(1)结合本研究northern blotting及western blotting结果初步认为前期在大鼠胰岛探测到的mini-P-糖蛋白并非MDR1/abcb1基因在mRNA水平上选择性剪切的结果,而可能为蛋白降解产物。(2)黄连素对P糖蛋白调控基因表达有影响,O.1μg/mL环孢菌素A与50ng/mL阿霉素对P糖蛋白相关基因表达影响不明显。