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大肠癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，近年来其发病率仍呈上升趋势，至今，对大肠癌的分子机制研究已经取得了很大的进展，众多依据表明，大肠痛是一种复杂的多阶段变化过程，是细胞内多种调控细胞生长和分化基因的累积变化导致肿瘤的表型变化。肠上皮细胞作为肿瘤的起始，经历了异形增生、早期腺瘤、中期腺瘤、晚期腺瘤、腺癌和转移腺癌的变化过程，其中，癌基因突变包括促细胞生长基因的激活、肿瘤抑癌基因的失活及细胞增殖负调节的综合效应，在大肠癌的发生发展过程中起重要作用。总之，大肠癌的形成至少包括5q染色体上的多发性结肠腺癌抑制基因(adenomatous polyposis coli，APC)、5q染色体上突变的MCC基因、18q染色体上的肠癌缺失的DCC基因、12p染色体上的K-ras基因和在17p染色体上的p53基因，这些基因变化的累积对肠癌的起始(突变)、促癌和／或增殖起着重要功能。 然而，近年来的研究资料发现，如10-15％的散发性结肠癌尽管无错配修复基因(MMR)突变，但仍导致微卫星不稳定性(MSI)，提示MMR基因失活存在着另一种机制或途径；而散发性结肠癌特别是MSI+结肠癌出现大量hMLH1基因CpG岛甲基化。因此，经典的基因改变遗传调控理论无法完全解释大肠癌相关基因的激活或失活，并逐渐认识到Epigentics(表遗传学或外遗传学)和DNA序列改 浙江大学博士研究生毕业论文变的遗传机制都参与肠癌的发生和发展〔6一，〕。 所谓表遗传学包括了基因转录与转录产物的加工和转译及其蛋白产物修饰等过程，是对基因表达变化的研究，它可通过减数分裂遗传，主要包括DNA甲基化和组蛋白去乙酞化〔8--9]，这种变化不涉及有关基因DNA序列的改变，其中DNA甲基化是表遗传调控重要方式。 DNA甲基化是指在DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase，DNMT)催化下，由S一酞普甲硫胺酸(S一adenosylmethionine，SAM)提供甲基在CpG二核普酸胞嚓睫的哦淀环第5位碳原子上加上甲基基团的共价修饰过程t’。〕。近年来普遍认为DNA甲基化与肿瘤抑制基因包括错配修复基因、血管生成抑制基因、细胞粘附分子相关基因的失活有关，是肿瘤发生的第三种机制。其中细胞周期素依赖性激酶抑制因子的甲基化对细胞周期的失控、肿瘤的形成起着重要作用。 细胞周期是指母细胞分裂结束后形成的细胞至其下一次再分裂终未形成两个子细胞的过程，是细胞分裂增殖的必然环节，它由Gl期、S期、G2期或M期组成。肿瘤的发生、发展和恶变与细胞周期失控密切相关，是细胞周期失控根木表现，细胞周期的顺利进行和完成依赖于一系列正负调节因子的相互作用，主要包括细胞周期素(cyClinS)、细胞周期素依赖性激酶(eyelin一dependent kinasos，CDKS)和细胞周期素依赖性激酶抑制因子(Cyelin一dependent kinase inhibitors，CK工S)〔’‘3。CKIS是近几年来分离得到的一类重要的细胞周期调控因子，按其结构和功能不同分为两类:即特异性针对CDK4/CDK6的抑制因子INK4(工nhibitorof CDK4)家族和广谱的CDKS及eyclin一CDKS复合物的CIP/KIP家族 (CDK一1 nteraeting protein/kinase inhibition protein)，CKIS参与细胞周期的负调控，可防止细胞过度增殖和恶变〔，2]，目前认为该家族基因的甲基化是其失活的主要原因。 为此，我们针对DNA甲基化共价修饰机理，对大肠癌细胞进行体内外的甲基化干预，探讨去甲基化对细胞CKIs家族及在大肠癌发生发展中的作用，为临床预防和治疗大肠癌的发生发展提供一个研究平台，并提供理论依据。第一部分肠癌RKO细胞CKIs启动子区CpG岛甲基化状态的检测 浙江大学博士研究生毕业论文 该部分应用甲基特异性pCR(Methylation一SpeCifiC PeR，MSP)和T一A克隆、DNA测序等方法，分别对大肠癌RKO细胞CKIS家族(包括INK4的p一5’nk‘h、pl6’”k‘丫CDKNZ基因和CIP/KIP家族的pZz/Cip、p27/kip)抑癌基因启动子区Cp(;岛甲基化状态进行了检测。结果发现:肠癌RKO细胞周期INK4家族(p巧‘nk仆及p16ink4a/C DKNZ)基因的启动子区DNA处于异常的高甲基化状态，而细胞周期Klp/Clp家族(pZI/eip及p27/kip)基因的启动子区epe岛未处于高甲基化状态;特异性DNA甲基转移酶抑制剂—5一Aza一2’一deoxycytidine能较好地逆转细胞周期INK4家族基因胞嚓睫的甲基化，并呈明显的量效依赖关系。第二部分DNA去甲基化对肠癌RKO细胞株CKIs基因转录表达的研究 为探讨DNA去甲基化对该族基因转录表达的影响，我们在本部分应用RT一PCR、Real一t ime PCR、免疫组织化学染色及western blot等技术检测了启动子区去甲基化后大肠癌细胞xNK4(p15‘nk‘b和pl6’nk‘“/CDKNZ)基因及无甲基化的Clp/KIP(p21/eip和p27/kip)基因的mRNA和蛋白表达水平，以阐明去甲基化对大肠癌细胞CKIS基因的影响。结果提示:高甲基化能明显抑制肠癌RKO细胞周期INK4家族(p15’n从‘b和pl6‘nk‘”/CDKNZ)的转录和表达，而去甲基化后能重新激活该基因表达，其中pls‘nk‘b和pl6‘nk‘a/CDKNZ基因mRNA表达较未经去甲