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性激素，通常分为雌激素、雄激素和孕激素，在人体内通过肾上腺素和各种酶的催化作用相互转化，调控人体生理机能，在生殖、性分化、妊娠和免疫系统调节等方面具有重要的生理作用。准确分析其血清中的浓度水平对不孕、性腺功能减退、多囊卵巢综合征等相关疾病的诊断和预防都具有重要意义。超高效液相色谱-三重四极杆质谱联用技术(UPLC-MS/MS)在检测的灵敏度、特异性、分析速度、多指标同时检测方面有很强的优势，是临床上检测血清激素的一种重要手段。
本研究选取临床上具有代表性的五种内源性激素作为研究对象，包括雄激素(雄烯二酮、睾酮)、孕激素(孕酮)、雌激素(雌酮、雌二醇)，通过使用液液萃取法(LLE)，结合UPLC-MS/MS技术，分别建立人血清中睾酮、雄烯二酮同时检测的分析方法，人血清中孕酮、雌酮、雌二醇同时检测的分析方法，并进行方法学验证，包括研究方法的专属性、线性、提取回收率、方法检出限、定量限、方法回收率与精密度、样品稳定性，并应用于血清样品的检测。主要研究内容如下：
1.建立了人血清中睾酮、雄烯二酮激素同时检测的UPLC-MS/MS方法，并对前处理方法、色谱条件和质谱参数进行优化。筛选出最佳色谱柱对目标化合物进行分离，确定流动相为乙腈／水(0.01%甲酸，v/v)体系，柱温40℃，流速0.3mL/min；考察了不同溶剂对提取效率的影响，结果表明乙酸乙酯/正己烷(70:30， v/v)溶液提取效率最高。所建立的方法专属性良好，目标物色谱峰附近无明显杂质干扰，在0.025~10ng/mL范围内有良好的线性关系，睾酮、雄烯二酮的方法检出限(LOD)为0.01ng/mL，定量限(LOQ)为0.025ng/mL；实验添加水平为0.05、0.5、5.0ng/mL时，无明显基质效应，提取回收率在73.28~94.92%之间，方法回收率范围为89.63~98.73%；日内相对标准偏差(RSD)小于6.5%；日间RSD小于7.5%；考察了血清样品在不同处理和放置条件下的稳定性，响应值变化RSD均低于15%，采用该方法对实际样本进行测定，结果显示在男性血清样本中，睾酮和雄烯二酮平均值分别为4.95ng/mL和2.23ng/mL，女性血清样本中，分别为0.67ng/mL和1.30ng/mL，均在正常生理范围内，表明该方法灵敏度高、准确可靠，可用于临床血清样本睾酮、雄烯二酮生理水平的检测。
2.建立了人血清中孕酮、雌酮、雌二醇同时检测的UPLC-MS/MS方法，对前处理方法、色谱条件和质谱参数进行优化。确定最佳流动相为甲醇／氨水(0.01mM)体系，柱温40℃，流速0.3mL/min；乙酸乙酯/正己烷(70:30，v/v)对目标物的提取效率最高，最佳提取体积800μL。方法专属性良好，在0.01~10ng/mL范围内具有良好的线性关系，孕酮、雌酮、雌二醇的LOD分别为0.005ng/mL、0.01ng/mL、0.01ng/mL，LOQ分别为0.01ng/mL、0.025ng/mL、0.025ng/mL；实验添加水平为0.05、0.5、5.0ng/mL时，无明显基质效应，提取回收率在61.39~89.55%之间，方法回收率范围为86.67~105.33%；日内RSD小于9.8%；日间RSD小于9.66%。考察血清样品在不同条件下的稳定性，响应值变化RSD均低于15%，采用优化后的方法对绝经前女性血清样本进行测定，结果显示孕酮的浓度范围为1.80~3.52ng/mL，雌酮的浓度范围为0.054~0.189ng/mL，雌二醇的浓度范围为0.086~0.436ng/mL，均在正常浓度水平。表明方法灵敏度高、准确可靠，可用于临床血清样本孕酮、雌酮、雌二醇生理水平的检测。
本研究选取临床上具有代表性的五种内源性激素作为研究对象，包括雄激素(雄烯二酮、睾酮)、孕激素(孕酮)、雌激素(雌酮、雌二醇)，通过使用液液萃取法(LLE)，结合UPLC-MS/MS技术，分别建立人血清中睾酮、雄烯二酮同时检测的分析方法，人血清中孕酮、雌酮、雌二醇同时检测的分析方法，并进行方法学验证，包括研究方法的专属性、线性、提取回收率、方法检出限、定量限、方法回收率与精密度、样品稳定性，并应用于血清样品的检测。主要研究内容如下：
1.建立了人血清中睾酮、雄烯二酮激素同时检测的UPLC-MS/MS方法，并对前处理方法、色谱条件和质谱参数进行优化。筛选出最佳色谱柱对目标化合物进行分离，确定流动相为乙腈／水(0.01%甲酸，v/v)体系，柱温40℃，流速0.3mL/min；考察了不同溶剂对提取效率的影响，结果表明乙酸乙酯/正己烷(70:30， v/v)溶液提取效率最高。所建立的方法专属性良好，目标物色谱峰附近无明显杂质干扰，在0.025~10ng/mL范围内有良好的线性关系，睾酮、雄烯二酮的方法检出限(LOD)为0.01ng/mL，定量限(LOQ)为0.025ng/mL；实验添加水平为0.05、0.5、5.0ng/mL时，无明显基质效应，提取回收率在73.28~94.92%之间，方法回收率范围为89.63~98.73%；日内相对标准偏差(RSD)小于6.5%；日间RSD小于7.5%；考察了血清样品在不同处理和放置条件下的稳定性，响应值变化RSD均低于15%，采用该方法对实际样本进行测定，结果显示在男性血清样本中，睾酮和雄烯二酮平均值分别为4.95ng/mL和2.23ng/mL，女性血清样本中，分别为0.67ng/mL和1.30ng/mL，均在正常生理范围内，表明该方法灵敏度高、准确可靠，可用于临床血清样本睾酮、雄烯二酮生理水平的检测。
2.建立了人血清中孕酮、雌酮、雌二醇同时检测的UPLC-MS/MS方法，对前处理方法、色谱条件和质谱参数进行优化。确定最佳流动相为甲醇／氨水(0.01mM)体系，柱温40℃，流速0.3mL/min；乙酸乙酯/正己烷(70:30，v/v)对目标物的提取效率最高，最佳提取体积800μL。方法专属性良好，在0.01~10ng/mL范围内具有良好的线性关系，孕酮、雌酮、雌二醇的LOD分别为0.005ng/mL、0.01ng/mL、0.01ng/mL，LOQ分别为0.01ng/mL、0.025ng/mL、0.025ng/mL；实验添加水平为0.05、0.5、5.0ng/mL时，无明显基质效应，提取回收率在61.39~89.55%之间，方法回收率范围为86.67~105.33%；日内RSD小于9.8%；日间RSD小于9.66%。考察血清样品在不同条件下的稳定性，响应值变化RSD均低于15%，采用优化后的方法对绝经前女性血清样本进行测定，结果显示孕酮的浓度范围为1.80~3.52ng/mL，雌酮的浓度范围为0.054~0.189ng/mL，雌二醇的浓度范围为0.086~0.436ng/mL，均在正常浓度水平。表明方法灵敏度高、准确可靠，可用于临床血清样本孕酮、雌酮、雌二醇生理水平的检测。