研究背景与目的中药藤黄(Gamboge)系藤黄科植物藤黄树(Garcinia hanburyi Hook. F. G)所分泌出的干燥树脂,近年来,其抗肿瘤作用受到高度关注。已经有研究表明,新藤黄酸(neogambogic acid. NGA)为藤黄抗肿瘤作用的主要有效成分之一,有望开发成抗肿瘤新药。但目前对其抗瘤谱的筛选尚不完全,尚未查阅到给药后新藤黄酸在体内分布的资料,对其抗肿瘤作用机制的研究也仅限于新藤黄酸对白血病细胞周期的影响,许多对该药物的应用较为重要的资料仍不完善。鉴于此,本文旨在进一步探讨新藤黄酸的体外和体内抗肿瘤活性,并在此基础上从细胞凋亡、细胞周期、细胞信号转导、端粒酶活性以及血管生成等角度入手,探索新藤黄酸的抗肿瘤作用机制,为新藤黄酸的开发及临床应用奠定理论基础。方法与结果1新藤黄酸的体外抗肿瘤作用运用MTT法和CCK-8法,通过测定新藤黄酸对体外培养肿瘤细胞的抑制率求出新藤黄酸对各肿瘤细胞株的IC50(半数抑制浓度),考察新藤黄酸对体外培养肿瘤细胞的抗增殖作用,结果发现新藤黄酸对非选择性获得的16株肿瘤细胞均具有抗增殖作用,IC50在1.14～4.25μg/mL之间,说明新藤黄酸具有确切的体外抗肿瘤活性(IC50<10μg/mL)。对人正常肝细胞株HL-7702的抗增殖实验结果显示,新藤黄酸对人正常肝细胞HL-7702的IC50为5.23±0.04μg/mL,新藤黄酸对人肝细胞癌Hep G2细胞株的IC50为1.22±0.12μg/mL,提示新藤黄酸对正常肝细胞的增殖有一定的抑制作用,但作用强度较其对肿瘤细胞的作用强度弱,推论在一定浓度范围内(1.25-2.50μg/mL)新藤黄酸具有选择性抑制肿瘤细胞增殖的作用。2新藤黄酸的体内抗肿瘤作用经过急性毒性试验,运用SPSS11.5统计学软件按机率单位加权回归法(Bliss法)计算得出新藤黄酸对小鼠的LD50(半数致死量)为36.66mg/kg,在此基础上确定小鼠实验的高、中、低三个剂量分别为8.0 mg/kg、4.0 mg/kg、2.0 mg/kg.采用荷S180腹水瘤小鼠模型,以存活时间为指标,观察新藤黄酸对动物肿瘤的体内抗肿瘤作用。结果显示,NGA中剂量(4.0 mg/kg)对延长荷瘤小鼠的存活时间效果最好,明显高于阳性对照药氟尿嘧啶(5-FU) (10.0 mg/kg)的疗效(P<0.05),但NGA高剂量(8.0 mg/kg)和NGA低剂量(2.0 mg/kg)的疗效均低于5-FU (10.0 mg/kg)的疗效(P<0.05),且NGA低剂量的平均存活时间与阴性对照组的差异无统计学意义(P>0.05)。提示新藤黄酸发挥治疗作用的剂量范围较窄,高剂量组的疗效比中剂量组差可能是由新藤黄酸的毒副作用所引起的。在建立小鼠血液及器官组织中新藤黄酸的HPLC测定方法后,建立荷S180实体瘤模型,考察给药后新藤黄酸在小鼠体内的分布情况。结果显示,腹腔注射后新藤黄酸在心、肝、肺、脾、肾及肿瘤组织中的峰浓度值分别为9.58±2.79、16.49±4.17、14.51±3.68、8.23±1.88、8.85±2.37、10.28±2.75μg/g,但在试验条件下,未能在脑组织中检测到新藤黄酸,其原因可能是新藤黄酸未能通过血脑屏障或者浓度水平未达到检测限。根据体内分布实验结果和体外实验结果,确定裸小鼠移植瘤模型的瘤株为人肝细胞癌Hep G2细胞株,建立人肝细胞癌Hep G2裸小鼠移植瘤模型,以相对肿瘤体积(relative tumor volume, RTV)和抑瘤率(inhibition rate of tumor growth, TGI)为指标考察新藤黄酸对人肿瘤的体内抗肿瘤作用,结果显示,新藤黄酸对人肝细胞癌Hep G2裸小鼠移植瘤的生长具有明显的抑制作用,在实验时间范围内,给药8d后,可观察到RTV随着给药剂量的增大而减小,给药14d后,阴性对照组、5-FU组、NGA高剂量(8.0 mg/kg)组、中剂量(4.0 mg/kg)组和低剂量(2.0 mg/kg)组的RTV分别为10.72±4.83、7.57±2.24、1.34±0.36、2.52±1.37和7.02±1.94；5-FU组、NGA高剂量(8.0 mg/kg)组、中剂量(4.0 mg/kg)组和低剂量(2.0 mg/kg)组的TGl分别为46.54%、83.75%、68.09%和22.14%；提示在一定剂量范围内,新藤黄酸具有确切的体内抗肿瘤作用。3新藤黄酸的抗肿瘤作用机制在确定新藤黄酸具有确切的抗肿瘤作用后,从细胞凋亡、细胞周期、细胞信号转导、端粒酶活性和肿瘤血管生成五个方面进一步研究新藤黄酸的抗肿瘤作用机制。采用Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测新藤黄酸干预后体外培养HepG2细胞的早期凋亡率,结果显示,早期凋亡率的最大值为(49.44±3.12)%,且出现在给药后24h,说明新藤黄酸具有诱导体外培养Hep G2细胞早期凋亡的作用。琼脂糖凝胶电泳DNA片段化分析的结果显示,新藤黄酸能使Hep G2细胞核DNA发生明显的降解,但未观察到细胞凋亡的特征DNA梯状条带,其原因可能是细胞在发生早期凋亡后,DNA又被进一步降解成200bp左右的片段。为了进一步研究细胞凋亡的机制,采用Western blot法检测给药后Hep G2细胞中凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2的水平,结果显示,Bax呈浓度依赖性升高,Bcl-2呈浓度依赖性降低；对照组、NGA(1.0μg/mL)组、NGA(2.Oμg/mL)组和NGA(3.0μg/mL)的Bax/Bcl-2比值分别为0.06、0.29、2.25和21.14。说明新藤黄酸在一定浓度范围内可以上调体外培养Hep G2细胞的Bax/Bcl-2比值。免疫组化法检测人肝细胞癌Hep G2裸小鼠移植瘤组织Bax、Bcl-2蛋白水平的结果显示,NGA低剂量(2.0mg/kg)组的Bax蛋白水平和Bcl-2蛋白水平与阴性对照组相比无显著差异(P>0.05),NGA中剂量(4.0mg/kg)组和NGA高剂量(8.0mg/kg)组的Bax蛋白水平明显高于阴性对照组,而Bcl-2蛋白水平明显低于阴性对照组；阴性对照组、NGA(2.0mg/kg)组、NGA(4.0mg/kg)组和NGA(8.0mg/kg)的Bax/Bcl-2比值分别为0.729、0.808、1.679和1.688。提示新藤黄酸在一定剂量范围内可以上调Hep G2裸小鼠移植瘤组织的Bax/Bcl-2比值。可见,体外试验结果和体内试验结果均支持新藤黄酸可通过上调Bax的水平和(或)下调Bcl-2的水平,从而升高Bax/Bcl-2比值诱导细胞凋亡。在对细胞周期进展的影响方面,采用PI单染流式细胞术检测处于各细胞周期时相的细胞数占总细胞数的百分比,结果显示,与对照组相比,给药后12～36h,S期细胞明显增多,在给药后48h,G0/G1期细胞增多,说明新藤黄酸能使细胞阻滞在S期,且随着时间的延长,能进一步使细胞阻滞在G0/G1期。在对MAPK细胞信号转导通路的影响方面,采用免疫组化法检测Ras/Raf/MEK/ERK级联通路中ERK和MEK的活化形式p-ERK1/2和p-MEK1/2的水平,结果显示,新藤黄酸可下调ERK1/2蛋白和MEK1/2蛋白的磷酸化水平,说明新藤黄酸可以通过下调ERK信号通路的信号引起细胞周期阻滞从而抑制细胞的增殖。但其调节点可能在Ras/Raf/MEK/ERK级联通路中MEK的上游,因为MEK的活化形式p-MEK1/2的水平也得到了下调。在对端粒酶活性的影响方面,采用荧光定量PCR法,检测端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)的mRNA水平来间接反映端粒酶的活性。结果显示,新藤黄酸给药各组Hep G2细胞的hTERT mRNA水平都明显低于对照组(P<0.05),且新藤黄酸给药各组的Hep G2细胞hTERT mRNA水平随给药浓度的升高而降低,各组间均有显著差异(P<0.05)。说明新藤黄酸对端粒酶活性具有抑制作用,且表现为浓度依赖性增强。据此推断,新藤黄酸可通过抑制端粒酶活性发挥体外抗肿瘤作用。在对肿瘤细胞血管生成的影响方面,运用免疫组化法检测Hep G2裸小鼠移植瘤组织中CD31(血小板内皮细胞粘附分子)的水平,从而反映新藤黄酸对肿瘤血管生成的影响,实验结果显示,新藤黄酸3个给药组的CD31阳性表达量IOD值均明显低于阴性对照组,且差异具有统计学意义(P<0.05),提示在一定浓度范围内,新藤黄酸可降低实体瘤组织的CD31水平,说明新藤黄酸对实体肿瘤的血管生成有一定的抑制作用。结论新藤黄酸具有广谱的体外抗肿瘤作用,在一定浓度范围内,新藤黄酸可选择性抑制肿瘤细胞的增殖,而对正常细胞的抗增殖作用相对较弱。新藤黄酸给药后能在小鼠体内广泛分布,其中以肝脏分布最高,在肿瘤组织中也有较高的分布；新藤黄酸可显著延长荷S180腹水瘤小鼠的存活时间,说明新藤黄酸对动物肿瘤具有确切的体内抗肿瘤活性；新藤黄酸能显著减小人肝细胞癌Hep G2裸小鼠移植瘤的相对肿瘤体积,抑瘤率可达到83.75%,说明新藤黄酸对人肝细胞癌Hep G2裸小鼠移植瘤具有确切的体内抗肿瘤活性。新藤黄酸可通过诱导细胞凋亡、阻滞细胞周期进展、抑制肿瘤血管生成而发挥抗肿瘤作用。新藤黄酸诱导肿瘤细胞凋亡与其对上调Bax/Bcl-2的比值有关。另外,新藤黄酸尚可通过下调MAPK/ERK信号通路关键酶的活性阻断MAPK级联反应,从而引起细胞周期阻滞,产生抗增殖作用；同时,细胞周期阻滞尚可诱导肿瘤细胞程序性死亡。