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背景脐带间充质干细胞(Umbilical Cord-derived Mesenchymal Stem Cells,UCMSCs)是一类具有高效增殖能力和多向分化潜能的成体干细胞,因其来源较广泛、易于获得且遗传背景稳定,已成为再生医学研究和应用的主要种子细胞之一。研究发现,移植到体内的UCMSCs并不能弥补组织器官损伤所丢失的功能细胞,其对组织器官的修复作用主要归因于其强大的外分泌效应。有研究表明,UCMSCs的条件培养基中可检测到促血管生长因子VEGF-A,并能促进内皮细胞增殖和血管生成。自噬(Autophagy)可维持细胞稳态,且在细胞代谢和功能发挥中起关键作用。研究表明,诱导自噬可增强牙周膜干细胞的外分泌效应。但目前关于强化自噬的UCMSCs条件培养基对血管生成是否有影响,并不清楚。目的探讨强化自噬的脐带间充质干细胞(UCMSCs)来源的条件培养基在体内外对血管生成的影响。方法1.用含不同浓度雷帕霉素(0 nM、100 nM、1μM和10μM)的培养基诱导培养UCMSCs 6 h,采用免疫荧光技术检测UCMSCs自噬水平。2.用上述含不同浓度雷帕霉素的培养基培养UCMSCs 6 h,弃去培养基,PBS洗涤细胞3次,更换新鲜培养基,培养24 h后收集条件培养基。3.利用上述条件培养基在铺有Matrigel的96孔板中培养人脐静脉内皮细胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells,HUVECs)3 h,显微镜下观察并记录各组HUVECs的成管效应,筛选出促进血管生成最明显的一组,并设为:优化条件培养基。4.利用4%水合氯醛(10 m L/kg)腹腔注射麻醉小鼠,在腹股沟处皮下注射混有HUVECs的Matrigel胶200μL,在Matrigel胶周围每天注射未经雷帕霉素诱导(0 nM组)和优化条件培养基,1周后麻醉小鼠进行安乐死,取出Matrigel胶,石蜡包埋、切片,进行HE染色及免疫荧光染色进一步验证优化条件培养基对血管生成的影响。5.利用新鲜培养基和优化条件培养基培养UCMSCs 6 h,提取RNA,q-PCR分析强化自噬对UCMSCs中VEGF-A、FGF-1、FGF-2、TGF-α、MMP-3、MMP-9、PDGF-α、PDGF-β、HIF-1α和Angiopoietin血管生成相关因子表达的影响。6.统计分析采用Graph Pad Prism 5软件。P<0.05,代表有统计学意义,其中*表示P<0.05,**表示P<0.01。所有的数据代表了至少3个独立实验的结果。结果1.免疫荧光染色结果显示,100 nM、1μM和10μM雷帕霉素均可增强UCMSCs自噬,且具有剂量依赖效应。2.体外HUVECs成管实验结果显示,与对照组(新鲜完全培养基)相比,未经雷帕霉素处理的(即:0 nM组)UCMSCs条件培养基和经100 nM、1μM和10μM雷帕霉素强化自噬的UCMSCs条件培养基均可促进HUVECs成管;其中以100 nM雷帕霉素诱导培养UCMSCs后的条件培养基促血管生成效应最为明显。3.体内成管实验结果显示,经100 nM雷帕霉素增强自噬的UCMSCs条件培养基促进Matrigel内微血管生成效应也明显优于未诱导自噬的UCMSCs条件培养基。4.q-PCR结果分析显示,强化自噬的UCMSCs中血管生成相关因子FGF-2、VEGF-A、MMP-9、HIF-1α和PDGF-α的表达均增强。结论在体内外,强化自噬的UCMSCs条件培养基均具有促血管生成作用。背景自噬是维持细胞稳态的重要生理因素,通常情况下,自噬可保护细胞免于凋亡,但在病理情况下,细胞自噬过度增强可诱导细胞凋亡,进而影响细胞的活性和各种生理功能。有研究表明,在高血压患者心肌组织中心肌细胞的自噬过度增强时刻导致细胞大量死亡,进而加速心力衰竭进展。本课题第一部分研究结果表明,强化自噬的UCMSCs条件培养基在体内外均具有促血管生成作用;但是,与低浓度(100n M)雷帕霉素强化UCMSCs自噬的条件培养基相比,10μM雷帕霉素强化自噬(过度自噬)的UCMSCs条件培养基的促血管生成效应相对较弱。这一结果提示,过度自噬或许引起了UCMSCs的其他病理生理反应,进而对内皮细胞的血管生成起一定的抑制效应。目的探讨强化凋亡的UCMSCs条件培养基在体内外对血管生成的影响。方法1.根据第一部分工作,利用含10μM雷帕霉素的培养基培养UCMSCs 6 h,按照凋亡试剂盒说明书利用流式细胞技术检测UCMSCs的凋亡水平。2.利用细胞凋亡诱导剂(CCCP:100μM)培养UCMSCs不同的时间(0 min、30 min和60 min),利用流式细胞检测技术检测细胞凋亡水平。3.用上述含CCCP的培养基培养UCMSCs不同时间,弃去培养基,PBS洗涤细胞3次;更换新鲜培养基,培养24 h后收集条件培养基。4.将HUVECs接种于Matrigel的96孔板中,利用上述条件培养基培养HUVECs 3 h,显微镜下观察并记录各组HUVECs的成管效应。5.利用4%水合氯醛(10 m L/kg)腹腔注射麻醉小鼠,在腹股沟处皮下注射混有HUVECs的Matrigel胶200μL,在Matrigel胶周围每天注射对照组条件培养基(UCMSCs未被CCCP诱导培养)和CCCP培养UCMSCs 60 min的条件培养基,1周后腹腔注射4%水合氯醛对小鼠进行安乐死,取出Matrigel胶,石蜡包埋、切片,进行HE染色及免疫荧光染色进一步验证优化条件培养基对血管生成的影响。6.利用新鲜培养基和含CCCP(100μM)的培养基培养UCMSCs 60 min,提取RNA,q-PCR分析强化凋亡对UCMSCs中VEGF-A、FGF-1、FGF-2、TGF-α、MMP-3、MMP-9、PDGF-α、PDGF-β、HIF-1α和Angiopoietin血管生成相关因子表达的影响。7.统计分析采用Graph Pad Prism 5软件。P<0.05,代表有统计学意义,其中*表示P<0.05,**表示P<0.01。所有的数据代表了至少3个独立实验的结果。结果1.流式细胞术检测结果显示,与对照组(未经雷帕霉素诱导培养)比较,10μM雷帕霉素诱导培养组UCMSCs凋亡率明显提高。CCCP诱导培养UCMSCs不同时间点细胞凋亡均明显增加,且具有时间依赖效应。3.体外HUVECs成管实验结果显示,与对照组(新鲜培养基)相比,未经CCCP诱导(0 min组)UCMSCs的条件培养基可促进HUVECs成管,而经CCCP培养UCMSCs 30 min和60 min后的条件培养基均可抑制HUVECs成管,其中以CCCP培养UCMSCs 60 min的条件培养基抑制血管生成效应最为明显。4.体内成管实验结果显示,与未经CCCP培养的UCMSCs条件培养基相比,经CCCP培养UCMSCs 60 min的条件培养基体内抑制血管生成效应明显。5.q-PCR结果显示,强化凋亡的UCMSCs中血管生成相关因子FGF-1、FGF-2、TGF-α、MMP-3和HIF-1α的表达明显减弱。结论在体内外环境下,强化凋亡的UCMSCs条件培养基具有抑制血管生成作用。