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放射治疗是根治恶性肿瘤的主要手段之一,临床约有70%的恶性肿瘤需要放射治疗,由于肿瘤细胞的生物学特性及局部微环境等因素的影响往往致放射治疗疗效不尽如人意,因此,寻找有效的放射增敏剂具有重要意义。一些放射增敏化合物,如米索硝唑(minsonidazole, MISO),虽然能特异性地增敏乏氧细胞,具有较好的增敏性,因其临床严重的毒副反应,大大限制了临床上的运用。由于中草药毒副作用小,中药放疗增敏剂日益受到重视。近年来,人们发现某些中药具有放射增敏效应[1]。榄香烯是从姜科植物温郁金中提取的非细胞毒性抗肿瘤药,具有广谱抗肿瘤作用,毒副作用小,能提高肿瘤放射增敏效应。过去对榄香烯抗癌作用机制的研究仅限于榄香烯对肿瘤细胞增殖、分化和凋亡、免疫原性等的影响,关于其作用靶点研究很少报道。本研究选用低细胞毒性的β-榄香烯作用于肺腺癌A549细胞,观察β-榄香烯对A549细胞体外放射增敏作用,初步探讨放射增敏作用靶点,为β-榄香烯放射增敏剂临床应用提供理论依据。目的:研究β-榄香烯对人肺腺癌A549细胞株放射敏感性的影响,探讨其放射敏感性与Ku70、Ku80 mRNA表达的关系。方法:本实验采用人肺腺癌细胞株A549作为研究对象,β-榄香烯由大连金港制药有限公司提供,细胞在RPMI-1640培养液中培养,实验组用含不同浓度(10ug/ml、20ug/ml、40ug/ml、80ug/ml、160ug/ml、320ug/ml)β-榄香烯RPMI-1640培养液进行培养,在不同照射剂量(2Gy、4Gy、6Gy、8Gy、10Gy)下直线加速器6MV-X线照射,采用MTT法测定不同浓度β-榄香烯对A549细胞的生长抑制率;克隆形成率观察β-榄香烯对A549细胞的放射增敏作用;RT-PCR法检测单纯β-榄香烯(10ug/ml、20ug/ml)联合放疗后KU70及KU80 mRNA的表达。结果:1.β-榄香烯作用A549细胞24h的半数抑制浓度(IC50)为120ug/ml。2.β-榄香烯对A549细胞有显著抑制作用,随着药物浓度的增大,OD值逐渐减小,细胞的抑制率逐渐增高(p<0.05)。3.20ug/mlβ-榄香烯作用24h后联合不同剂量照射的A549细胞测OD值。单纯放疗(0Gy、2Gy、4Gy、6Gy、8Gy、10Gy)组其OD值分别为0.964士0.025、0.825士0.012、0.758士0.042、0.623士0.011、0.544士0.031、0.376士0.015,20ug/mlβ-榄香烯作用24小时后联合上述不同剂量照射的放疗组OD值分别为0.828士0.009、0.650士0.022、0.562士0.016、0.474士0.011、0.345士0.015、0.205士0.014。结果提示:相同剂量下,20ug/mlβ-榄香烯联合放疗组OD值均较单纯放疗组降低。统计学分析组间有显著性差异(P<0.05)。初步判断β-榄香烯对A549细胞有放射增敏作用。4.10ug/ml和20ug/mlβ-榄香烯作用24小时后联合不同剂量的细胞克隆数及存活率的检测,单纯放疗(0Gy、2Gy、4Gy、6Gy、8Gy、10Gy)组克隆数分别为97士3.12、82士2.35、64士3.17、45士2.06、24士3.18、12士1.64,10ug/mlβ-榄香烯作用24小时后联合上述照射剂量放疗组细胞克隆数分别为92士3.23、73士2.51、55士3.84、36士4.08、17士3.21、7士1.63;20ug/mlβ-榄香烯作用24小时后联合上述照射剂量放疗组细胞克隆数分别为88士3.09、65士4.25、42士3.87、28士1.67、12士1.59、4士1.10。结果提示:10ug/ml、20ug/mlβ-榄香烯作用24小时后联合上述照射剂量放疗组较单纯放疗组细胞克隆数明显下降,统计学分析各组间有显著性差异(P<0.05);且10ug/ml、20ug/ml两浓度组之间亦有显著性差异(p<0.05)。因此,克隆形成率进一步证明β-榄香烯在低细胞毒性浓度下对A549细胞有放射增敏作用,且随药物浓度逐渐增加,放射增敏作用逐渐增强。5.20ug/mlβ-榄香烯作用24h与48h后的细胞集落结果及存活率结果比较有显著性差异(p<0.05)。单纯照射(0Gy、2Gy、4Gy、6Gy、8Gy、10Gy)后细胞克隆数分别为97士3.12、82士2.35、64士3.17、45士2.06、24士3.18、12士1.64;20ug/mlβ-榄香烯作用24h后联合上述剂量放疗组细胞克隆数分别为88士3.09、65士4.25、42士3.87、28士1.67、12士1.59、4士1.10;20ug/mlβ-榄香烯作用48h后联合上述剂量放疗组细胞克隆数分别为76士2.15、47士3.42、30士2.37、17士1.80、5士1.09、0士0.0。统计学分析组间有显著性差异(P<0.05)。提示β-榄香烯在低细胞毒性浓度下对A549细胞有放射增敏作用,且随作用时间增加,放射增敏作用增强。6.Ku70与Ku80的表达:Ku80及Ku70的mRNA在10ug/ml与20ug/ml联合放疗各组细胞中均有表达,与对照组比较,单纯放疗组表达略有增加,单纯榄香烯组表达略有减少,两者与对照组比较,统计学分析无明显差异(P>0.05)。β-榄香烯(10ug/ml、20ug/ml)联合放疗组Ku80及Ku70 mRNA表达明显低于单纯放疗组,统计学分析组间有显著性差异(P<0.05);20ug/mlβ-榄香烯联合放疗组表达低于10ug/mlβ-榄香烯组联合放疗组,统计学分析组间有显著性差异(P<0.05)。提示β-榄香烯的放射增敏作用可能通过下调KU80、KU70的表达实现。结论:1.β-榄香烯对A549细胞的增殖有明显的抑制作用, IC50为120ug/ml,抑制率随着药物浓度的增加而增强,且抑制作用有剂量依赖性。2.β-榄香烯在低细胞毒性浓度下对A549细胞有放射增敏作用,并随浓度的增加和时间的延长,放射增敏作用增强,其增敏作用有浓度及时间依赖性。3.单纯放疗及单用β-榄香烯对A549细胞Ku70、Ku80的mRNA表达与对照组比较无明显影响;二者联合作用可使A549细胞Ku70、Ku80的mRNA表达明显下降,推测β-榄香烯可能通过下调Ku70、Ku80的mRNA表达增加A549细胞的放射敏感性