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乳汁这种原本为哺乳动物哺育后代的营养品,已经成为现代人类生活中的必不可少的重要食品。乳品中含有大量的优质蛋白质、脂类、必需维生素以及矿物质。乳被誉为“最接近完美的食品”。乳腺上皮细胞是泌乳的最基本的结构和功能单位,通过开展乳腺上皮细胞泌乳机理的研究,将为建立高效的泌乳调控技术提供理论依据和技术途径。这些基础理论依据和技术,对于乳业和畜牧业的发展均具有重要意义。此外,在生物学领域,探寻调节乳蛋白合成的分子机理也是一项重要的科学问题。促乳素是调控乳蛋白合成、促进细胞增殖分化的重要外源激素,已有研究表明促乳素可以通过调节Tudor-SN(tudor staphylococcal nuclease)来调控乳腺上皮细胞的增殖和乳蛋白合成。Tudor-SN作为一个多功能蛋白质,通过应答氨基酸、激素等外源信号,来调控细胞增殖和乳蛋白合成,但Tudor-SN发挥调节作用的具体分子机理尚不清楚。本研究以奶牛乳腺上皮细胞(bovine mammary epithelial cells,BMECs)为实验材料,通过系统的实验设计,阐明了促乳素通过激活JNK(c-Jun N-terminal kinase),JNK进而磷酸化激活Tudor-SN,磷酸化Tudor-SN发生入核,在细胞核内Tudor-SN与STAT5(signal transducer and activator of transcription 5)转录激活因子相互作用,从而调控细胞增殖和乳蛋白合成。本课题深入揭示了Tudor-SN在促乳素作用下通过磷酸化激活调控乳腺上皮细胞增殖和乳蛋白合成的分子作用机理。本研究发现促乳素能激活Tudor-SN的Thr103位点磷酸化,磷酸化的Tudor-SN进入核内。通过Western blot实验发现,促乳素明显增强了磷酸化Tudor-SN的表达水平。通过免疫荧光和Western blot发现,促乳素能促进Tudor-SN的磷酸化入核。T103A点突变实验表明,103位点突变的Tudor-SN不能再入核。这些结果提示,促乳素通过信号转导将Tudor-SN磷酸化激活并入核。为了探究Tudor-SN的上游激活机制,本实验通过Co-IP(co-immunoprecipitation)方法证明了Tudor-SN由激活的JNK来磷酸化,JNK是Tudor-SN的上游激酶。通过在培养的BMECs中加入JNK特异性抑制剂(SP600125)和激活剂(anisomycin)来改变JNK的活性,进而再观察促乳素对Tudor-SN磷酸化入核的情况。Western blot和免疫荧光结果显示,抑制JNK后Tudor-SN无法再在Thr103位点发生磷酸化,而激活JNK后Tudor-SN的磷酸化水平明显提高。以上结果表明,JNK是Tudor-SN的上游激酶。为了探究JNK是否介导了促乳素调控Tudor-SN,本实验通过Western blot、免疫荧光和流式细胞计数方法,检测了在加入JNK抑制剂后,分别再添加促乳素和过表达Tudor-SN,进而再观察其调节细胞增殖和乳蛋白合成的变化情况。结果表明,在加入JNK抑制剂后,添加促乳素和过表达Tudor-SN都无法再促进细胞周期从G1期到S期的转换,无法促进细胞增殖,促进乳蛋白合成的调节效应也明显受到抑制。以上结果表明,促乳素对细胞增殖和乳蛋白合成的调控作用依赖于JNK信号分子。为了探究磷酸化Tudor-SN在核内发挥的生物学效应,运用Co-IP方法发现磷酸化的Tudor-SN与STAT5存在相互作用。Western blot和免疫荧光的结果显示,Tudor-SN和STAT5被促乳素所激活。同时利用Western blot和流式细胞方法,检测了在siRNA干扰STAT5后,分别再添加促乳素和过表达Tudor-SN,进而再观察它们调节细胞增殖和乳蛋白合成的变化情况。结果表明,在siRNA干扰STAT5后,添加促乳素和过表达Tudor-SN都无法再促进细胞周期从G1期到S期的转换,无法再促进细胞增殖,促进乳蛋白合成的调节效应也明显受到抑制。以上结果表明,磷酸化的Tudor-SN在细胞核内与STAT5相互作用,从而调控细胞增殖和乳蛋白合成。综上所述,Tudor-SN介导促乳素调控BMECs增殖和乳蛋白合成。促乳素通过JNK磷酸化Tudor-SN,磷酸化的Tudor-SN进入细胞核后与STAT5相互作用调节BMECs增殖和乳蛋白合成。