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本研究通过生物信息学的方法对几种贝类的NCBI EST数据库进行分析,寻找免疫相关的基因,并分析其功能。采用RACE技术获得了几个相关基因的全长cDNA序列,并对其中具有研究意义的基因(铁硫蛋白基因,铁蛋白基因,巨噬细胞表达蛋白基因,唾液酸结合凝集素)做进一步的功能分析;使用实时定量PCR技术检测不同的基因在弧菌感染胁迫下表达的变化,探索可能的、与抗病相关功能基因的时空表达模式,确定这些基因的表达与抗病性状的关联。对重要基因进行真核或原核表达,进行体内、外进行相关功能分析。为进一步研究这些抗逆基因的表达调控机制提供重要的基础信息,将为深入了解抗病性状分子机制奠定坚实的基础。
1.利用电子克隆的方法从太平洋牡蛎(Crassostrea gigas)EST数据库获得了Rieske基因全长cDNA序列,并研究了它在各组织中的表达情况,以及其亚细胞定位。该Cgisp基因全长cDNA长度为985 bp,包含了35 bp5-非编码区(UTR)和161bp3-UTR,及786 bp开放阅读框编码262个氨基酸。原核表达分析Cgisp蛋白分子量为30 Kda,与预测的相符。同源分析和分子结构模型模拟揭示Rieske蛋白的保守[2Fe-2S]簇结合位点,其三级结构与3CWB-E(Gallus gallus)高度匹配。多序列对比分析得出,其可能存在11个SNP位点和两个保守的六肽序列,BoxⅠ(THIGC)和BoxⅡ(PCHGS)。实时定量PCR分析表明,Cgisp广泛存在于各组织中,其中在与闭壳肌中最多,表明其生理功能与能量传递相关。亚细胞定位分析表明,绿色荧光蛋白标记的Cgisp定位于线粒体,进一步支持了其生理功能。
2.从海湾扇贝(Argopecten irradians,Lamarck1819)中克隆了两个铁蛋白基因(Aiferl和Aifer2)。它们的cDNA全长分别是1019和827 bp,分别编码171和173个氨基酸。每个铁蛋白亚基的5-UTR均包含一个保守的铁反应元件(IRE)。序列分析表明这两个铁蛋白都属于H-铁蛋白家族,都在亚铁氧化酶中心含有七个保守的氨基酸。组织分布分析表明,Aiferl在外套膜和闭壳肌中分布最多,而Aifer2则只在闭壳肌中分布最多。这两个铁蛋白基因在细菌感染后的扇贝中显示出差异表达,Aifer1的表达水平在细菌感染6个小时后敏锐地上调(超过10倍),而Aifer2表达量在整个感染的过程中没有显著差别。这两个基因的读码框都能在大肠杆菌中高效表达,产生分子量相近约23 KDa的重组蛋白。纯化后的重组Aiferl和Aifer2在浓度为5 mg/mL时分别表现出33.1％和30.4%的铁离子熬合活性。阳离子Mg2+,Zn2+和Ca2+都能抑制这两种蛋白的铁螯合活性。此外,表达有重组Aiferl和Aifer2的大肠杆菌细胞均具有H2O2的耐受性,这为铁蛋白抗氧化功能提供了直接的证据。这些结果表明了这两种来自海湾扇贝的铁蛋白在铁代谢,免疫调控和抗氧化压力方面的重要作用。
3.MPEGs(巨噬细胞表达的基因)编码的蛋白是MACPF(膜攻击复合物/穿孔素)蛋白超家族中的成员,在先天免疫中发挥重要作用。我们从太平洋牡蛎中克隆到一个Mpeg1同源体,命名为Cg-Mpeg1。Cg-Mpeg1的全长cDNA为2781 bp,包含一个2226 bp的ORF,编码742个氨基酸,预测含有一个19-aa的疏水信号肽,一个MACPF结构域和一个跨膜区。系统发育树分析表明,Cg-Mpeg1跟其他软体动物的MACPF蛋白类似,可能起源于一个古老的祖先基因并发生在原口动物和后口动物分化之前。亚细胞定位研究显示,Cg-Mpeg1蛋白主要出现在晚期内涵体。Cg-Mpeg1的MACPF结构域表现出显著的抗菌活性,能抑制革兰氏阴性和阳性细菌的生长。此外,实时定量PCR分析表明,Cg-Mpeg1分布于各个组织中,其中在鳃和性腺的表达量最高。更多的是,Cg-Mpeg1 mRNA水平在溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)感染后明显上调。这些结果突出Cg-Mpeg1在宿主防御和消灭病原体方面起着至关重要的作用。
4.凝集素在生物体中在免疫防御方面起着重要的作用,我们通过RACE方法从香港巨牡蛎(Crassosttea.hongkongensis)中克隆唾液酸结合凝集素的全长cDNA序列(命名为Ch-salectin)。Ch-salectin长531 bp包含21 bp的5-UTR,39 bp的3-UTR和468 bp ORF编码156个氨基酸。它跟H.pomatia和H.discus discus的唾液酸结合凝集素序列分别有38%和35%的相似性。它被认为是唾液酸结合凝集素家族的新成员,并能与含唾液酸的胎球蛋白相结合。Ch-salectin蛋白含有一个信号肽和一个保守的补体Clq结构域。在溶藻弧菌感染过程中,其转录水平明显向上调节,表明其参与了香港巨牡蛎的免疫反应。此外,纯化的MBP标记的Ch-salectin蛋白表现出显著的抗菌活性,能够抑制革兰氏阴性和阳性细菌的生长。总之,这些结果突出了Ch-salectin基因在香港巨牡蛎抵御细菌感染的免疫防御中的重要作用。