胰岛素样生长因子Ⅰ(Insulin-like GrowthFactorI，IGF-I)是从血清中发现的一种多功能生长因子，可促进多种细胞的增殖、分化、生长。研究证实，IGF-I对动物繁殖及生长性能提高具有促进作用，同时对于多种疾病的治疗及修复具有重要的作用。但IGF-I在血清中的含量很低，依靠纯化天然的IGF-I根本无法满足基础研究及临床应用需求。 本试验运用大肠杆菌原核表达系统及毕赤酵母真核表达系统分别进行猪IGF-I(plGF-I)基因体外表达研究，针对不同的表达系统，通过PCR克隆及体外合成拼接分别获得目的基因，并将pIGF-I基因分别克隆至原核表达载体pGEX-KG及真核表达载体pPIC9K中，进行表达研究，为利用IGF-I蛋白进行基础研究及临床应用奠定基础。 1．构建pIGF-I成熟蛋白的原核表达载体，表达plGF-I成熟蛋白与GST蛋白的融合蛋白。利用已经构建好的含有plGF-I全长cDNA的质粒，设计含有合适酶切位点的引物，应用PCR技术扩增得到含有plGF-I信号肽与成熟蛋白序列的基因，将其克隆至原核表达载体pGEX-KG中，构建了重组质粒，经PCR筛选、酶切鉴定和核苷酸序列测定，确定重组质粒pKG-IGF-I构建完全正确。将重组质粒pKG-IGF-I转化宿主菌BL21 (λDE3)，经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导目的基因表达，SDS-PAGE电泳分析表明，重组菌可表达分子量约为37 kDa的重组蛋白。 2．重组菌进行大规模发酵，菌体经超声波破碎，SDS-PAGE电泳分析表明，目的蛋白主要以可溶性形式存在于裂解液上清中。上清经不同饱和度硫酸铵分级纯化后，与佐剂混合免疫新西兰大耳兔，于第三次加强免疫后，耳缘静脉采血，琼脂糖扩散实验检测抗体效价。从心脏采血分离的血清，经ELISA检测，抗体的效价达1:800。 3．采用酵母偏爱密码子合成五条编码plGF-I基因的引物，利用重叠PCR技术拼接获得长度为210bp的猪IGF-I成熟蛋白基因。在基因两端引入合适的酶切位点，将该基因克隆至毕赤酵母分泌表达载体pPIC9K中，转化巴斯德毕赤酵母菌。经表型鉴定、PCR分析及G418筛选得到Muts型多拷贝整合菌，以1.5％甲醇诱导培养。经SDS-PAGE检测表达产物，在7-5 kDa处出现一特异蛋白条带，表达量达410mg／L。Dot Blot免疫印迹分析显示，此真核表达蛋白能与抗plGF-I多克隆抗体发生特异性反应。