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多菌灵(Carbendazim)是一种广谱、高效内吸性苯并咪唑类杀菌剂,由于其杀菌谱广、低毒、使用方便,在保护地蔬菜中常年广泛应用。然而其化学性质稳定,在土壤中降解半衰期较长,能持久地残留在使用部位,故菜地土壤中已经有相当高程度的积累。分离筛选能够高效降解多菌灵的微生物是人们目前进行多菌灵环境污染治理、土壤生物修复的一种有效途径。因此寻找并研究多菌灵降解菌是十分必要的。
本研究以长期大量使用多菌灵的寿光蔬菜大棚土壤为研究对象,通过富集培养分离得到2个降解多菌灵效果较好的菌株,结合生理生化特性、菌落形态特征及菌株特异性序列分析等手段,确定其分类归属;并对其降解多菌灵的特性进行了研究。其主要研究结果如下:
1.从长期施用多菌灵的保护地蔬菜田土壤中经富集培养分离纯化得到68个细菌菌株,反复测定其降解能力,最终得到一株降解多菌灵效果较好的细菌菌株CD09-13。该菌在30℃、200r/min、pH7.0的条件下培养3d,对浓度为100㎎/L的多菌灵的降解率为85.89%。
2.对菌株CD09-13主要生理生化特征进行分析,结果表明:菌株在PB培养基平板上培养48h,形成圆形菌落,菌体红色、黏性、光滑、突起、边缘整齐、不透明、气味难闻。100倍油镜下观察菌体呈短杆状。革兰氏染色阴性;菌株的接触酶试验、乙酸氧化试验、产H2S试验、明胶液化试验阳性;淀粉水解试验、V-P试验、甲基红试验、吲哚试验均为阴性;葡萄糖氧化发酵试验结果为发酵型。该菌株的16S rDNA序列分析结果表明,其与Serratia liquefaciens有较高的同源性(99%)。综合菌株CD09-13的生理生化特性及16S rDNA系统进化分析结果,确定该菌为沙雷氏菌属(Serratia)的液化沙雷菌(Serratia liquefaciens)。
3.考察了培养温度、pH值、接种量3个因素对菌株CD09-13降解能力的影响,以对多菌灵的降解率为指标,证明菌株CD09-13降解多菌灵的最适温度为30℃,最适pH为7.0,最适接种量为5%。
4.采用单因素试验与正交试验相结合的方式对菌株CD09-13发酵培养基配方进行优化,结果表明菌株在以葡萄糖为最佳碳源,蛋白胨为最佳氮源的培养基中菌体生长量最大;综合考虑各因素对发酵液菌体生长量、多菌灵降解率以及经济方面的影响筛选出发酵条件的最优组合为A1B1C1D2E2,即发酵培养基配方为:葡萄糖5g,蛋白胨3g,NaCl1g,MgSO4·7H2O1g,K2HPO41.5g,蒸馏水1000ml。
5.从长期施用多菌灵的保护地蔬菜田土壤中分离纯化得到一株对多菌灵降解效果较好的真菌菌株CF-2。该菌在25℃、140rpm/min、pH7.0的条件下培养7d,对浓度为100㎎/L的多菌灵降解率为54.56%。
6.菌株CF-2在PDA平板上培养一周,菌落粉白色,菌丝突起呈絮状,白色质密。镜检观察,菌株产生两种形状、大小不同的孢子,大孢子镰刀形多隔膜,小孢子椭圆形。测得菌株的5.8S rDNA-ITS区序列在NCBI中进行BLAST分析。系统聚类分析发现菌株CF-2菌株和镰刀菌属的尖孢镰刀菌亲缘关系最近,一致率达100%,综合菌株CF-2的菌落形态特征及5.8S rDNA-ITS区序列分析结果,将CF-2菌株鉴定为尖孢镰刀菌(Fusarium.oxysporum)。