论文部分内容阅读
背景与目的结肠癌转移相关基因1(metastasis-associated in colon cancer1, MACC1)是新近发现的与结肠癌转移相关的基因,其在多种肿瘤组织中存在异常高表达。MACC1是HGF/c-Met信号通路的关键调控点。目前,尚无MACC1与宫颈癌相关的报道,MACC1是否会参与宫颈癌的发生发展、其对宫颈癌发生发展的分子机制如何、其对宫颈癌的临床意义何在,这些问题一直困扰着我们。本研究主要探讨MACC1、肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor, HGF)和c-Met在不同宫颈病变组织中的表达,分析了MACC1、HGF和c-Met的异常表达与宫颈癌临床病理因素的关系,评价了MACC1、HGF和c-Met在宫颈癌中表达的临床意义,进一步探讨了MACC1、HGF和c-Met的表达与人类乳头瘤病毒(human papillomavirus, HPV)感染在宫颈癌的发生发展中的关系。为揭示宫颈癌的发生发展机制,指导宫颈癌的临床诊断及治疗提供新的思路。方法1.采用免疫组织化学技术检测40例正常宫颈组织、20例宫颈上皮内瘤样变组织和100例宫颈癌组织中MACC1、HGF和c-Met的表达情况,比较不同宫颈组织中MACC1、HGF和c-Met表达的阳性率。2.采用PCR技术检测40例正常宫颈组织、20例宫颈上皮内瘤样变组织和100例宫颈癌组织中HPV DNA表达,比较不同宫颈组织中HPV DNA表达的阳性率3.分析MACC1、HGF和c-Met在宫颈癌中的异常表达与临床病理参数的关系。4.探讨宫颈癌组织中MACC1、HGF和c-Met异常表达的相关性。5.分析MACC1、HGF和c-Met在宫颈癌组织中的阳性表达与HPV持续感染的相关性。结果1. MACC1、HGF、c-Met和HPV DNA在宫颈癌、宫颈上皮内瘤样变组织中阳性表达率明显高于正常宫颈组织中的表达,差异有统计学意义(P<0.05)。2.在宫颈癌组织中MACC1、HGF和c-Met的阳性表达率与临床分期、组织学病理分级和淋巴结转移相关,差异有统计学意义(P<0.05),三者在宫颈癌组织中的阳性表达率随着临床分期的变晚、组织病理分级变差和淋巴结转移的出现阳性率逐级上升；HPV DNA的阳性表达与宫颈癌的临床分期、组织学病理分级、淋巴结转移均无关(P>0.05)。3.在宫颈癌组织中MACC1的异常表达与HGF、c-Met的异常表达呈正相关(Spearman r=0.68, P=0.000; Spearman r=0.71, P=0.008), HGF蛋白与c-Met蛋白表达呈正相关(Spearman r=0.75, P＝0.000)。4. MACC1、HGF和c-Met的阳性表达与HPV的持续感染密切相关(Spearman r=0.420, P=0.000)。结论1.在宫颈癌组织中MACC1、HGF和c-Met基因均过表达。2.在宫颈癌组织中MACC1-HGF/c-Met-HPV形成了正反馈环,其对于宫颈癌的发生发展发挥了重要作用。3. MACC1的过度表达促使致癌HPV感染的细胞异常增殖并恶变。4. MACC1有望成为宫颈癌早期诊断及基因治疗的新靶点。5.联合检测MACC1的表达和HPV的感染,将有助于癌前病变的诊断、病程进展的判断及患者预后的评估。背景与目的MACC1是新近报道的一种与调控肿瘤生长和转移的关键基因,在多种高转移性肿瘤中高表达。前期研究结果证实,MACC1在宫颈癌组织中呈高表达,并与肿瘤临床分期、组织病理分级、淋巴结转移密切相关。为了更好的了解MACC1在宫颈癌发病机制中的作用,分析MACC1与宫颈癌细胞的生物学行为的关系,本研究通过人工合成MACC1基因特异的siRNA(small interfering RNA)序列,并转染到宫颈癌HeLa细胞中,特异性抑制MACC1基因表达。最终研究并分析MACC1对宫颈癌HeLa细胞增殖、迁移和凋亡等的影响,初步阐明了MACC1参与宫颈癌发生发展的分子生物学机制,为宫颈癌的预防、早期诊断及RNA干扰技术治疗宫颈癌提供理论和实验依据。方法1.化学合成MACC1基因特异的siRNA序列,利用阳离子脂质体Lipofectamine2000转染到HeLa细胞。2.采用免疫荧光染色观察MACC1siRNA转染HeLa细胞后细胞骨架形态的变化。3.采用RT-PCR和Western blot方法检测转染前后HeLa细胞中MACC1mRNA和蛋白水平的变化情况。4.采用Transwell迁移实验观察MACC1siRNA转染前后HeLa细胞迁移能力的改变。5.采用MTT法检测MACC1siRNA转染前后HeLa细胞生长增殖能力的变化。6.采用流式细胞仪检测MACC1siRNA转染前后HeLa细胞的凋亡能力和细胞周期的变化。结果1. MACC1siRNA在转染HeLa细胞后,细胞内整齐束状排列的骨架蛋白变成错综复杂的网状结构,且无方向性,部分断裂呈粗大的颗粒,散乱分布于胞浆；HeLa-siRNA细胞组、HeLa-NC细胞组和未转染的HeLa细胞组细胞骨架蛋白F-actin的积分荧光强度分别为：10.01±3.53、17.44±5.85和18.53±3.61.2.在HeLa-siRNA细胞组MACC1mRNA的相对表达量是:0.47±0.06, HeLa-NC细胞组是：0.88+0.09,未转染的HeLa细胞组是：1.00+0.00,经统计学分析HeLa细胞在转染MACC1siRNA后,细胞MACC1mRNA表达水平明显降低,与HeLa-NC细胞组及未转染的HeLa细胞组相比,差异均有统计学意义(P<0.05),而HeLa-NC细胞组和未转染的HeLa细胞组MACC1mRNA的相对表达量相比,差异无统计学意义(P>0.05)。3.在HeLa-siRNA细胞组、HeLa-NC细胞组及未转染的HeLa细胞组中MACC1蛋白的相对表达量分别为：0.46±0.05、0.96+0.05和1.01±0.27. MACC1蛋白在HeLa-siRNA细胞组中的相对表达量与HeLa-NC细胞组及未转染的HeLa细胞组的相比,差异均有统计学意义(P<0.05),而HeLa-NC细胞组和未转染的HeLa细胞组MACC1蛋白的相对表达量相比,差异无统计学意义(P>0.05)。4. Transwell实验、MTT实验和流式细胞仪检测技术观察到转染MACC1siRNA后,HeLa细胞的迁移、增殖能力明显减弱,而凋亡明显增加,细胞周期G0/G1和G2/M期细胞比例也发生了明显的变化。结论1.应用RNA干扰技术能有效的抑制HeLa细胞内MACC1基因的表达。2. MACC1基因的表达抑制能够改变HeLa细胞的生物学行为,如增殖和迁移能力受到抑制,凋亡率明显增加,同时将更多的细胞阻滞在G0/G1和G2/M期。3.检测MACC1基因的表达,对于宫颈癌的预防、早期诊断和选择基因治疗的特异性靶点有非常重要的意义。4.随着RNA干扰技术的发展,MACC1siRNA有望成为宫颈癌基因治疗的新策略。