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研究目的：1.进一步明确将斑马鱼作为牙齿发生发育分子生物学研究模型的可行性和先进性。2.研究牙齿发育的重要信号因子（Pax9基因、Pitx2基因）在斑马鱼牙齿萌出与替换过程中的表达部位和时间,以探讨Pax9基因、Pitx2基因在牙发生发育过程中的作用机制及作用途径。3.研究淫羊藿苷对牙齿生长发育的影响。这将加快实现牙齿再生目标,并将为选取中药进行牙齿再生的体内实验提供一定的理论依据。研究方法：1.斑马鱼的饲养及其受精卵的获得：将饲养野生型斑马鱼的水温控制在28.5℃,设定其昼夜规律分别为14小时和10小时。将通过自然交配获得的受精卵饲养于28.5℃水中。斑马鱼的发育阶段按下述方法来划分：孵化期（0—6天龄）；幼虫期（1—4周龄,即7—49天龄）；幼体期（1—3月龄,即30—89天龄）；成熟期（3月龄以上）。2.成年斑马鱼牙齿形态和组织学观察：在体视显微镜下,解剖成年斑马鱼鳃弓,观察其牙齿,并做石蜡切片和HE染色观察。取单个牙齿进行组织学标本处理,扫描电镜下观察其显微结构。3.针对Pax9基因原位杂交探针的制备：根据斑马鱼Pax9基因mRNA序列（GenBank: NM131298）设计和合成针对Pax9的引物（F:5’-gcaagcttatggaaatctgcagaggcct; R: 5’-gctggatcccgctcgtcctcctggaa gtagaa）。抽提斑马鱼基因组总RNA,反转录成cDNA,并以此为模板,扩增Pax9基因序列。1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。将纯化的PCR扩增产物连接到pGEMT （Promage, Cat.#A3600）载体中,然后转化到DH5α感受态菌株中克隆扩增质粒。将大量扩增抽提得到的连接载体质粒经内切酶消化,在含有地高辛标记的UTP的体外转录系统中,以T7聚合酶催化合成地高辛标记的RNA探针,用于整胚原位杂交。4.Pax9基因在受精72h以内斑马鱼胚胎中的分布和表达：参考Westerfield M. The Zebrafish Book. Eugene:University of Oregon Press,1995.中的整胚原位杂交和胚胎切片方法,取不同发育阶段的胚胎（以4h为观察间隔）,用4%多聚甲醛溶液固定过夜（至少固定12h）,保存于甲醇溶液中,置-20℃备用。用1×PBST溶液洗去多余的甲醇溶液,将胚胎置于65℃水浴箱进行预杂交3h,然后加入所合成的反义RNA探针,65℃水浴杂交过夜。用0.2×SSC溶液洗去多余的探针,加入anti-Dig-AP与反义RNA探针结合过夜。将未结合的抗体用1×PBST溶液洗去,再加入（BCIP/NBT/NTMT）显色30min,迅速用1×PBST溶液洗去多余的显色液,将此胚胎直接在显微镜下观察并记录结果。5.通过制备针对Pitx2基因的探针（同研究方法3）,利用整胚原位杂交技术（同研究方法4）观察Pitx2基因在斑马鱼牙齿早期发育中的表达情况。6.研究淫羊藿苷对牙齿生长发育的影响：在饲养野生型斑马鱼的水中加入淫羊藿苷,观察45天后斑马鱼牙齿生长发育的变化。在扫描电镜下观察其牙齿的显微结构,并对Ca、P等微量元素做能谱分析。7.研究淫羊藿苷对人牙龈成纤维细胞的中药干预作用：对体外培养的人牙龈成纤维细胞（human gingival fibroblasts,HGF）,用MTT法检测不同浓度的淫羊藿苷（0.001、0.01、0.1μg/mL）、不同时间（24、48、72、96h）作用下HGF的增殖水平。研究结果：1、扫描电镜下,斑马鱼牙齿硬组织也具有类似人类牙釉质和牙本质样的结构。人类牙齿的釉质表面有平行排列的与牙长轴垂直的浅凹线纹和不规则的圆形小凹。斑马鱼牙齿表面未见浅凹线纹,但是有一些与牙长轴垂直的颜色较深的条带,在外形变化大的牙尖处尤为明显,这可能同人类牙釉质表面的线纹一样和釉质沉积有关。人类牙齿的牙本质具有牙本质小管,为多孔性组织结构,牙本质构成髓腔,髓腔内充满牙髓等软组织。斑马鱼的釉质内侧组织也呈多孔性疏松组织结构,具有很多贯穿其内的孔隙,与人类牙齿的牙本质结构相似。斑马鱼牙齿的牙本质也围成一髓腔,其内也可见软组织。HE染色进一步观察到红染的牙本质内部为一髓腔,髓腔内具有丰富的牙髓细胞。2、得到了Pax9基因在0到7天各时期斑马鱼胚胎中的表达资料,其中Pax9基因在受精16h的斑马鱼胚胎中开始有特异性信号出现,还可以明显地看到鳃弓（鳃弓,包括牙齿是由神经嵴细胞迁徙分化而来）上的特异性信号从24h-72h的迁徙和发育的过程。3.得到了Pitx2基因在0到7天各时期斑马鱼胚胎中的表达资料,明显地看到鳃弓上的特异性信号从16h-72h的迁徙和发育的过程。4.与对照组相比,实验组（加淫羊藿苷组）中斑马鱼牙齿冠1/3和中1/3的Ca含量显著升高,P含量显著降低,Ca/P比值显著升高。淫羊藿苷对斑马鱼牙齿生长发育中的钙化沉积有明显的促进作用。5.淫羊藿苷（0.001～0.1μg/mL）对人牙龈成纤维细胞（human gingival fibroblasts, HGF）的增殖具有促进作用（P<0.01）,而且呈时间依赖性,促进HGF增殖的最佳浓度为001μg/mL。结论：1.进一步明确了斑马鱼作为牙发生发育分子生物学研究模型的可行性和先进性。从组织结构和超微结构上分析,斑马鱼牙齿和人类牙齿具有相似性,能够作为研究牙齿发生发育的新型模式动物。2.掌握了Pax9基因、Pitx2基因在斑马鱼牙齿发育和替换过程中的的早期表达情况。为揭示Pax9基因、Pitx2基因功能及信号通路等后续研究奠定了基础。3.淫羊藿苷对牙齿生长发育中的钙化沉积有明显的促进作用。淫羊藿苷对人牙龈成纤维细胞有中药干预作用,可以促进牙龈再生。这将为选取中药进行促牙周组织再生的体内实验提供一定的依据。利用中西医结合共同研究牙齿生长发育的机制,加快实现牙齿再生