目的:1探讨18β-甘草次酸通过刺激肝癌细胞产生ROS,诱导DNA损伤,导致肝癌细胞凋亡,进而抑制肝癌细胞增殖的分子作用机制。2初步探讨在肝癌治疗中18β-甘草次酸及甘草酸与顺铂的协同增效作用。方法:1 18 β-甘草次酸诱导肝癌细胞凋亡,抑制肝癌细胞增殖的分子作用机制1.1体外实验研究1.1.1 18 β-甘草次酸对人肝癌细胞增殖的抑制作用在p53野生型人肝癌细胞株HepG2、QGY-7703及p53突变型人肝癌细胞株Huh-7、sk-hepl中,通过MTS细胞增殖检测试剂盒检测浓度梯度18β-甘草次酸对细胞生长的增殖抑制作用,初步确定最佳作用浓度及时间。为验证18β 甘草次酸对肝癌细胞的抑制作用是否为p53依赖性,我们进一步使用上述浓度梯度的18 β-甘草次酸分别处理人结肠癌细胞株HCT116的p53野生型及其p53敲除型两株细胞24h、48h、72h及96h,然后经MTS检测细胞增殖率变化。1.1.2 18β-甘草次酸对人肝癌细胞凋亡的影响通过Annexin V-FITC/PI染色方法,经流式细胞仪检测18β-甘草次酸在HepG2、QGY-7703细胞中是否能诱导细胞凋亡。通过免疫蛋白印迹法检测凋亡相关PARP片段的剪切cleaved-PARP表达,验证18 β-甘草次酸诱导细胞凋亡作用。1.1.3 18 β-甘草次酸对人肝癌细胞DNA损伤的影响通过免疫荧光法检测DNA双链断裂损伤标志γ-H2A.X的焦点数目,判断18 β-甘草次酸是否能引起人肝癌细胞发生DNA损伤。在蛋白水平,经免疫蛋白印迹法检测细胞周期检查点DNA损伤感受器分子ATM的活化磷酸化水平,及γ-H2A.X的活化磷酸化水平,验证18β-甘草次酸对人肝癌细胞DNA损伤的影响。1.1.4 18β-甘草次酸对p53促凋亡通路的影响通过qPCR法检测在p53野生型肝癌细胞株中,18 β-甘草次酸对p53促凋亡下游主要靶基因PUMA、NOXA及负反馈基因MDM2的影响,使用WB检测18 β-甘草次酸对p53凋亡相关磷酸化位点Ser 15磷酸化水平的影响,观察18 β-甘草次酸是否能够影响p53促凋亡通路。1.1.5 18 β-甘草次酸对人肝癌细胞ROS生成的影响18β-甘草次酸分别处理HepG2、QGY-7703细胞后,进行DCFH-DA染色,经流式细胞仪检测ROS阳性细胞率及DCF荧光强度,观察18 β-甘草次酸对细胞内ROS产生的影响。1.1.6 ROS对18 β-甘草次酸所致DNA损伤的影响采用抗氧化剂NAClmM预处理肝癌细胞6h后,加入0.2mM VitC及110 μ M β-巯基乙醇与200μM18 β-甘草次酸共同处理HepG2、QGY-7703细胞24小时,通过MTS细胞增殖实验检测抑制ROS生成后,对肝癌细胞增殖抑制率的影响。同时通过蛋白印迹法检测经上述处理后γ-H2AX的表达,进而观察ROS对18 β-甘草次酸所致的肝癌细胞DNA损伤有无影响。1.2甘草酸对NODSCID小鼠人肝癌细胞移植瘤的抑制作用1.2.1甘草酸对免疫缺陷小鼠移植瘤的体积及瘤重的影响通过对NODSCID小鼠皮下接种人肝癌细胞成功建立肝癌移植瘤模型后,给予不同剂量药物处理,(1)空白对照组:生理盐水,0.2ml;(2)甘草酸低剂量组:45mg/kg;(3)甘草酸高剂量组:135mg/kg;(4)顺铂组:2mg/kg;(5)联合组:甘草酸45mg/kg+顺铂2mg/kg。均为腹腔注射,顺铂隔日一次,甘草酸每日一次,使用14天。治疗过程中,每日记录小鼠体重,隔日测量各组小鼠肿瘤体积,用游标卡尺测量肿瘤2个互相垂直的直径,长径A,短径B,按公式V=AB2/2计算体积。根据肿瘤体积绘制生长曲线并计算肿瘤相对增殖率。停药24小时后使用戊巴比妥钠过量麻醉处死小鼠,完整剥取皮下肿瘤,称瘤重,计算抑瘤率。比较各组与对照组瘤重及瘤体积的变化,同时比较顺铂组与顺铂及甘草酸联合组之间有无差异。1.2.2 TUNEL法检测甘草酸对人肝癌移植瘤凋亡的影响制备石蜡切片,使用TUNEL试剂盒染色,经激光共聚焦扫描显微镜观察计数凋亡率,比较各组药物的影响有无差异。2 18β-甘草次酸及甘草酸与顺铂的协同增效作用2.1体外实验2.1.1 18 β-甘草次酸与顺铂抑制肝癌细胞增殖的协同作用在p53野生型细胞系HepG2、QGY-7703及p53突变型细胞系Huh-7中,我们使用浓度梯度(100μ M、200μM、300 μM)的18 β-甘草次酸分别与5g/L的顺铂联用,处理上述细胞24-48H,使用MTS检测对细胞增殖率的影响。2.1.2 18 β-甘草次酸在p53促凋亡通路中与顺铂的协同作用使用qPCR方法检测了p53野生型细胞株QGY-7703细胞中,18β-甘草次酸与顺铂联合使用对p53促凋亡靶基因NOXA、PUMA及负反馈因子MDM2的影响。2.2甘草酸在小鼠移植瘤模型中与顺铂的协同作用方法如1.2.1所述,观察在小鼠体内两药是否存在协同效果。结果:1.1 18 β-甘草次酸刺激肝癌细胞生成ROS,引起DNA损伤,导致细胞凋亡1.1.1 18β-甘草次酸经p53非依赖方式抑制肝癌细胞增殖分别使用浓度梯度(100μM、200μM、300μM)的18 β-甘草次酸处理四株人肝癌细胞HepG2、QGY-7703、Huh-7及sk-Hepl,24小时后,MTS细胞增殖实验结果表明,200 μM及300 μM 18 β-甘草次酸对这四株肝癌细胞的增殖都有明显的抑制作用。MTS细胞增殖实验结果证明,18 β-甘草次酸可以有效抑制人肝癌细胞的增殖。上述四株肝癌细胞中,HepG2、QGY-7703为p53野生型细胞系,Huh-7、sk-Hepl为p53突变型细胞系,18β-甘草次酸对此两类细胞均具有明显的杀伤作用,提示18β-甘草次酸可能是通过p53非依赖性途径抑制肝癌细胞增殖。为进一步验证18β-甘草次酸抑制肝癌细胞增殖的p53非依赖性,我们使用了 p53野生型的人结肠癌细胞系HCT116及其p53敲除后细胞,同样浓度梯度的18β-甘草次酸处理两株细胞24h、48h、72h、96h后,经MTS实验检测增殖抑制率。发现200μM、300 μ M的18 β-甘草次酸对这两株细胞也表现出了明显的杀伤作用,但两株细胞的增殖抑制率在同时间同药物浓度比较均没有明显差异。证明18β-甘草次酸抑制肿瘤细胞的增殖并不依赖于p53通路。1.1.2 18 β-甘草次酸诱导肝癌细胞发生凋亡使用100μ M、200 μ M的18 β-甘草次酸分别处理HepG2细胞24小时、QGY-7703细胞16小时后,经胰酶消化细胞制成单细胞悬液,使用Annexin V-FITC/pI染色后经流式细胞仪检测,结果提示,18β-甘草次酸呈浓度依赖的诱导这两株肝癌细胞发生凋亡。蛋白印迹法(western blotting)检测PARP剪切的变化,结果发现,与对照组比较,不同浓度18β-甘草次酸分别处理QGY-7703细胞16小时及HepG2细胞24小时后,cleaved-PARP含量均明显增加,总PARP酶原条带对应减少。流式细胞凋亡检测结果及cleaved-PARP水平增加,可说明18β-甘草次酸能够诱导肝癌细胞株HepG2、QGY-7703发生凋亡。1.1.3 18 β-甘草次酸引起DNA损伤免疫荧光结果显示,在HepG2细胞中,经200μ M18β-甘草次酸处理8小时后,单个细胞核中foci数目大于5个的细胞数与空白对照组相比明显增多,而细胞核中未观察到foci的细胞数明显少于空白对照组,说明与对照组比较,18β-甘草次酸处理后发生DNA损伤的细胞明显增加,同时细胞DNA损伤的程度也明显加重。同样在QGY-7703细胞中,也观察到经200μM18β-甘草次酸处理细胞6h后,细胞核中>5个foci的细胞数较对照组明显增加,细胞DNA损伤程度加重。蛋白印迹法(western blotting)结果显示,200 μM18β-甘草次酸分别处理HepG2细胞4小时、8小时及12小时后,Ser1987位点的ATM磷酸化水平随药物处理时间延长逐渐增加。在QGY-7703细胞中,200μ M18 β-甘草次酸分别处理1小时、3小时及5小时后,同对照组比较p-ATM(Ser1987)及γ-H2A.X的磷酸化水平逐渐增加。1.1.4 18 β-甘草次酸激活p53促凋亡通路qPCR结果显示,18 β-甘草次酸处理HepG2细胞24小时后,NOXA、PUMA的表达量明显上调,对p53负反馈因子MDM2无明显影响。其中对NOXA作用最为显著,100μ M18 β-GA处理后NOXA表达上调14.35±1.086倍。QGY-7703细胞经18β-甘草次酸处理16小时后,NOXA、PUMA、MDM2表达均上调,其中也是NOXA上调最为显著,200 μ M处理后基因表达上调11.32±0.1528倍。WB检测结果发现在这两株细胞中,18β-甘草次酸处理后p53凋亡相关位点Ser15的磷酸化水平明显增加。1.1.5 18 β-甘草次酸可刺激肝癌细胞产生ROS在HepG2细胞中,经200μM18β-甘草次酸处理2H后,DCF的荧光强度开始明显增强,3H达高峰,4H后开始逐渐下降,8H的荧光强度继续降低。在QGY-7703细胞中,18β-甘草次酸处理1h后,DCF荧光值较空白对照组即显著增加,而3H检测点虽ROS阳性细胞较1H时无明显改变,但荧光值开始下降,至5H继续降低,ROS阳性染色细胞率仍高于空白对照组。1.1.6抑制ROS产生后减轻了 18 β-甘草次酸导致的DNA损伤MTS细胞增殖实验结果显示,抑制ROS产生后,18β-甘草次酸对HepG2、QGY-7703细胞的增殖抑制率明显下降。蛋白印迹法检测抗氧化剂抑制细胞ROS产生后,对18β-甘草次酸诱导DNA损伤的影响。在QGY-7703细胞中,经抗氧化剂与18 β-甘草次酸共孵育5小时后,γ-H2A.X的表达量较未经抗氧化剂处理组明显降低。这提示ROS参与18 β-甘草次酸诱导肝癌细胞DNA损伤过程。1.2甘草酸对小鼠人肝癌移植瘤无明显抑制作用1.2.1甘草酸未能抑制移植瘤生长肿瘤相对体积比较,低浓度及高浓度甘草酸均未抑制肿瘤增殖。解剖后剥取瘤体称重,甘草酸组与对照组瘤重也无差异。1.2.2甘草酸可以增加移植瘤中细胞凋亡率使用蔡司激光共聚焦显微镜观察及拍照,避开肿瘤坏死区域,计数>1000个细胞中TUNEL阳性染色细胞数,计算凋亡指数。结果与对照组比较,甘草酸高低剂量组、顺铂组、联合用药组凋亡率均有增加,以联合用药组增加最明显,且与顺铂组有统计学差异。2.1 18 β-甘草次酸与顺铂在抑制肝癌细胞增殖中具有协同增效作用MTS结果显示,在p53野生型细胞系HepG2、QGY-7703及p53突变型细胞系Huh-7中,浓度梯度(10OμM、200μM、300μM)18β-甘草次酸分别与5g/L的顺铂联用后,增殖抑制率均比两药单药组明显增加,且低浓度联用即有明显效果。qPCR结果显示,在QGY-7703细胞中,18β-甘草次酸与顺铂联用后p53促凋亡靶基因的表达量均较单药组明显上调。这说明18β-甘草次酸与顺铂在p53促凋亡通路中也存在协同效应。2.2甘草酸与顺铂在抑制小鼠移植瘤的生长中具有协同效果肿瘤终末体积比较,顺铂组与生理盐水对照组比较存在统计学差异。联合用药组抑制肿瘤增殖作用最为明显,与对照组比较差异有明显统计学意义。同时,顺铂单药组与顺铂加甘草酸联合用药组比较,差异具有统计学意义,提示甘草酸增强了顺铂杀伤肝癌细胞的作用,可能对顺铂耐药细胞具有增殖抑制作用。剥取肿瘤后称瘤重,结果与对照组瘤重比较,各单药组的抑制效果与对照组比较没有统计学差异,联合用药组表现出了明显的抑制效果,抑瘤率达68.87%,同时与顺铂、甘草酸单药组比较,均具有统计学差异。结论:1体外实验结果提示,18 β-甘草次酸抑制肝癌细胞HepG2、QGY-7703细胞增殖的机制为:18 β-甘草次酸刺激肝癌细胞产生大量ROS,过多的ROS超过了细胞的清除能力不能被清除,进而攻击细胞基因组DNA,造成DNA双链断裂,细胞周期检查点传感蛋白ATM感受DNA损伤被激活,磷酸化ATM的下游底物,在p53野生型细胞中可磷酸化活化p53凋亡相关位点,使其下游促凋亡基因NOXA、PUMA表达上调,激活促凋亡通路,启动细胞凋亡信号级联反应,caspase活化相关PARP剪切增加,最终导致肝癌细胞凋亡。2体外细胞学实验证明,18 β-甘草次酸是经p53非依赖性途径抑制人肝癌细胞增殖,同时,18 β-甘草次酸与顺铂在对肝癌细胞的杀伤作用中也存在协同效应。另外,在p53野生型肝癌细胞中18 β-甘草次酸可激活p53促凋亡通路,且与顺铂联用后对p53促凋亡下游靶基因的上调作用明显强于顺铂及18β-甘草次酸单药组。在小鼠荷人肝癌移植瘤模型中,甘草酸与顺铂联用与顺铂、甘草酸单药比较,抑瘤率明显增加。p53在顺铂抗肿瘤作用中占重要地位,也已证实顺铂的耐药机制与p53突变有重大关系,而18 β-甘草次酸对肿瘤细胞的p53非依赖性杀伤作用,可以杀死部分对顺铂耐药的细胞,同时在p53野生型细胞中也能对p53促凋亡通路发挥协同增效作用。18 β-甘草次酸与顺铂抗肝癌细胞增殖的协同增效机制仍需进一步深入探讨。3 18-甘草次酸为甘草酸在体内的水解产物,但18 β-甘草次酸为脂溶性,体内给药剂型困难,而甘草酸类制剂作为临床用药已有数十年历史,其体内药效成分即为其水解产物18β-甘草次酸,给药方式更为灵活。顺铂是目前肝癌的首选化疗药物,但铂类药物存在严重的耐药问题,寻找新的更有效的替代化疗药物或化疗增敏药物是目前研究热点。结合我们在体外获得的数据,甘草次酸可以协同增效顺铂对肝癌细胞的杀伤作用,我们应用数倍于临床剂量的甘草酸以期在体内达到甘草次酸抗肿瘤浓度,同时探索临床常用剂型甘草酸与顺铂在体内联用是否能够增加对肝癌的杀伤作用。但我们使用的低浓度及高浓度甘草酸对小鼠移植瘤并没有明显的抑制效果,这可能与甘草酸在NODSCID小鼠体内代谢为18 β-甘草次酸的效率低,未达到其抗肿瘤浓度有关。对此,我们需要进一步直接应用18 β-甘草次酸在荷瘤小鼠体内给药,来验证其体内抗肿瘤效果。而低浓度甘草酸与顺铂联用即获得了比顺铂单药显著的抑瘤效果,这与我们在体外实验中发现的低浓度甘草次酸即可与顺铂在抑制肝癌细胞增殖及p53促凋亡通路中发挥协同增效效应相同。