研究背景及目的:2004年,南方医科大学实验动物中心的顾为望教授等人从西藏把西藏猪引种到亚热带地区——州率先进行实验动物化研究和风土驯化,并将其命名为西藏小型猪(Tibetminipig)。同时对西藏小型猪的生产繁殖性能、生理生化指标以及基因遗传多态性等生物学特性方面进行了较为全面系统的研究。西藏小型猪是中国乃至上体型较小的小型猪之一,来源于青藏高原、海拔2500-4300米的农区及半农牧区,是唯一能适应高海拔气候并且能够以放牧为主的猪种,封闭的地理环境使西藏小型猪拥有非常纯正的品种资源。由于体型小、便于操作,而且解剖、生理生化特性与人特别相近的特点,小型猪已逐渐成为生物医药研究领域重要的实验动物,应用数量逐年大幅递增。目前转基因动物的研制是生命科学领域至关重要的技术,通过基因敲除技术以及转基因技术改变动物基因的组成,能够按照实验设计者的构想来改变实验动物的基因组成,获得满足实验设计者实验条件的基因工程动物。目前进行转基因以及基因敲除的研究在小鼠身上是最为成熟的,常用的方法为原核显微注射法以及ES细胞方法。而在猪的身上,进行胚胎干细胞方法,虽然有一些成功的案例,但是由于猪的胚胎细胞培养不稳定,且没有得到产业化生产及大规模推广的水平。另外相对于小鼠来说,猪的受精卵的来源还是相当有限的,且在猪的受精卵内存在过多的脂肪滴,也是很不利于原核显微注射的。因此,利用传统的原核显微注射的方法以及ES细胞的方法,是很难获得基因敲除及转基因猪的[1,2,3,4]。随着体细胞核移植技术的不断成熟,越来越多的转基因克隆猪以及基因敲除的猪都是用该技术制备的。该方法主要是通过基因工程的方法对体细胞的细胞核内的基因进行修饰或敲除,然后再利用体细胞核移植技术对猪机体的基因水平进行修饰,获得基因修饰的克隆猪的[1,2,3,4]。在进行体细胞修饰的时候[5],选择体细胞的种类种类很多:目前常用于转基因猪植被的核供体细胞类型主要有:①来源于个体的生殖系统的细胞,如卵丘细胞、颗粒细胞、输卵管上皮细胞、原始生殖细胞、未成熟的睾丸支持细胞。这些细胞虽说可以提供核细胞核,但是在方法学还是比较难获得,或者通过外科手术等,操作时间较久,工作难度大。②来源于成年或者新生个体的非生殖系统的细胞,如皮肤成纤维细胞、猪耳成纤维细胞、肌肉细胞、尾尖成纤维细胞以及脂肪细胞等等。这里细胞在方法学上,获得比较简单,只要通过局部消毒及麻醉,就可获得所需细胞,且细胞的获取多来自成年或者初生小猪,与胎儿成纤维细胞相比较,无需等待30多天再进行剖腹取胚胎,且进行外科操作比较容易获得,可随时获得需要细胞。但此类细胞也存在一些弊端,一般我们进行体细胞核移植的供核细胞,我们需要其在体外传代至少10代以上,其作为转基因核供体细胞才能够进行一系列的功能验证。而做基因敲除动物,则需要在体外传更多的代数。故此类细胞,虽简单易得,但是需要作为核供体仍需要进行体外传代验证。③来自猪胚胎的细胞,如猪胎儿成纤维细胞。这类细胞的特点主要是,增值能力旺盛、传代次数多、核型稳定、易于分离培养,且形成的重构胚胎的发育能力比较强,体外培养的时间久。此类细胞获得也比较容易获得,但是也需要进行外科手术获得,且每次获得后都以杀死一头怀孕母猪为代价,且获得的细胞性别需要后期进行鉴定。④来自淋巴系统的细胞,如终末分化的B细胞、T细胞;这类细胞具有丰富的来源、取材且方便回输、易于体外的扩增、且可以特异性的结合体内特定抗原位点等诸多优点。⑤干细胞,如骨髓干细胞、胚胎干细胞(embryonic stem cells,ES),诱导多功能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPS)。这类细胞具有无限增殖、自我更新及多向分化的能力。有文献报导[7]认为,在猪中,相比较猪胎儿成纤维细胞,骨髓间充质干细胞最为细胞核供体获得更高的囊胚率和更好的胚胎质量,但是干细胞系的建立、保存都是一项难度很高的技术,对技术和经费的要求都很高,所以这使得干细胞在转基因及基因敲除技术中的运用受到很大的限制。在选择和供体的细胞的时候,通常需要考虑实验目的、动物的福利、取材是否便利,在生产转基因猪的过程中,尤其是制作基因敲除模型动物,我们通常选择体外培养旺盛、筛选期时间长,相对比较容易获得胎儿成纤维细胞进行。Cre/lox P系统为真正具有严密开/关功能的调控系统,其由Cre重组酶和Cre特异识别的loxP位点组成;当细胞中同时存在Cre和两个同向lox P位点时,lox P位点间的DNA片段被切除,并进而通过远侧两个粘性末端的连接进行DNA重组。Cre/lox P系统介导条件性基因表达的策略。置于启动子与目的转基因之间,在(细胞核内)无Cre蛋白存在时,STOP cassette下游靶基因将完全不表达,而当(细胞核内)Cre存在时,将介导DNA重组移除STOP信号盒,并进而诱导休眠转基因开始表达。肝脏表达的多种蛋白质都与动物的很多生理病理现象有关,对于其表达基因进行条件性敲除是进行相关研究的手段之一。Cre-LoxP重组酶系统提供了强有力的手段,是我们可以在特定的组织器官以及细胞中研究特定的基因功能,作为研究各种疾病的模型。而目前,主要建立的由各种组织特异表达性的Cre重组酶的转基因大小鼠。但是大小鼠与人类无论是在个体的大小还是在生理生化方便都与人类差距较大,而猪与大小鼠相比较于人类更加接近。本文利用肝脏特异性表达的白蛋白启动子(Albuminpromoter),利用in-fusion克隆的方法,建立Cre酶表达的载体,最终建立,转肝脏特异表达Cre重组酶的猪成纤维细胞系,为下一步建立肝脏特异表达Cre重组酶的转基因猪奠定基础。而目前用不同的启动子来驱动的Cre重组酶可以达到时间及空间上基因表达的调控,表现出组织、细胞的特异性,但是启动子的特异性到底有多强,且Cre重组酶是否能够介导重组,重组的效率是多少,都没有系统化的评价标准。对此,本文通过建立pCIR载体转基因西藏/巴马小型猪,专门用于评价组织特异性的Cre转基因猪的整合效率。本文通过对本单位持有品种西藏小型猪及巴马小型猪进行胎儿成纤维细胞分离传代验证是否能够在体外多次传代用于制作转基因及基因敲除等修饰。且欲获得能够取代胎儿成纤维细胞进行供核的猪耳成纤维细胞的分离培养及传代验证。(一)Alb-Cre转基因猪胚胎成纤维细胞系的建立及相关功能验证血清白蛋白是哺乳动物细胞肝脏合成的一种蛋白质,约占肝脏新合成的蛋白的5%~10%。血清白蛋白只能由分化成熟的肝细胞合成,而其他组织的白蛋白基因处于关闭状态。许多学者对于白蛋白这种的组织特异性进行了深入的研究。研究发现,白蛋白的合成受到肝脏生长发育的阶段影响,在发育过程中合成的量随着时间的推移及肝脏的发育,白蛋白的浓度逐渐升高,到成年期达到最高。白蛋白的表达主要在转录水平上受到调控。鉴于组织特异性的启动子在外源基因和组织细胞特异性表达、基因治疗等有重要的前景,本文拟通过白蛋白启动子在猪胚胎成纤维细胞内的功能活性的验证,为将来建立肝脏特异表达转基因克隆猪奠定基础。那么如何检测外源性的Alb启动子有没有转入细胞内部呢。在猪的胎儿成纤维细胞上白蛋白启动子是没有活性的,如何监测细胞载体是否导入体细胞核移植的供核细胞呢?我们将抗性基因嘌呤霉素(Puromycin,PURO)和绿色荧光蛋白报告基因(Green fluorescent protein,GFP)用泛表达启动子PGK来调控且用T2A连接。其中,抗性基因PURO可用于抗性的筛出转入载体阳性的细胞,而GFP可以用来检测药物筛选是否筛选出的细胞都已经是阳性的。(二)西藏小型猪猪耳成纤维细胞系的建立体细胞核移植技术在农业、生物学基础研究和生物制药及人类医学研究领域具有很大的发展潜力。目前已有多种克隆动物的产生,其中,供核体细胞是影响核移植效率的关键因素之一。而目前核供体细胞多采用猪胎儿成纤维细胞(Porcine Embyo fibroblast cells,PEFs),获得这种成纤维细胞多需要将怀孕35天左右的母猪经剖腹产取胚胎后进行。经过发情、配种后到怀孕35天需要一段时间的等待,对实验的进度有所影响。此外,细胞经过反复冻存,传代增殖能力会有所影响。本研究致力于从新生猪耳组织上分离获得成纤维细胞,作为核供体细胞,经实验探索,获得稳定细胞系。且正在进行体外传代能力的测试。方法(一)Alb-Cre转基因猪胚胎成纤维细胞系及其功能验证1.载体 pAlb-Cre-PGK-GFP-T2A-PURO(pACGP)的构建及载体pCALL2-IRES-RFP(pCIR)的确认1.1载体pACGP的构建以质粒pAlb-Cre-GH/BS作为模板,PCR扩增目的基因Alb-Cre片段,电泳后进行胶回收,通过In-Fusion克隆至Nhe I/Cla I 的载体pCDH-EFl-MCS-GFP-Puro 中。1.2载体pCIR的确认将质粒pCIR分别用内切酶bglⅡ及EcoR Ⅴ,Xho I,EcoRI进行初步鉴定,鉴定无误后再对将关键元件所在部位进行引物设计,后测序,测序结果与预期序列进行比对。2.pACGP及pCIR的功能验证2.1载体pCIR的整合能力的确认用质粒pCIR转染293T细胞及猪胚胎成纤维细胞PEF(porcine embryonic fibroblasts),48~72小时在荧光倒置显微镜下面观察荧光情况,后进行X-gal(β-galactosidase stain)染色。2.2载体pCIR与Cre重组酶识别的功能验证用载体pCIR和pLV-CIG共转染293T细胞及PEFs,感染72小时,观察红色荧光、绿色荧光及用X-gal进行染色。2.3载体pACGP的功能验证pACGP转染293T细胞及PEFs,感染72小时,观察红色荧光、绿色荧光。用载体pCIR和pACGP共转染293T细胞及PEFs,感染72小时,观察红色荧光、绿色荧光及用X-gal进行染色。3.ACGP-PEFs 及 CIR-PEFs 的建立3.1 pACGP构建肝脏特异表达Cre猪胎儿成纤维细胞系用包装质粒PMD2G和PsPAX2及pACGP以8/3:5:20/3的比例(单位:ug)共同感染细胞293T细胞,60小时后收集病毒上清,离心过滤后的病毒上清感染PEFs,感染后72小时观察荧光,后加嘌呤霉素进行筛选,直到所有细胞有GFP的表达,筛选停止。3.2载体pCIR构建LoxP表达转基因猪胎儿成纤维细胞系用电转染的方法对将载体pCIR转染PEFs,转染后24小时进行1:20传代,传代后用G418筛选2周,筛选浓度为lmg/ml,后维持浓度为500ug/ml,维持1周。将筛选出的细胞部分用X-gal染色,鉴定细胞是否建系成功。(二)西藏小型猪猪耳成纤维细胞系的建立取新生西藏小型猪出生1～2周时,剪取指甲盖大小的猪儿皮肤,后经过加入5%的青链霉素混合液的(Penicillin-Streptomycin Solution,PS)磷酸盐缓冲液冲洗(Phosphate Buffered Saline,PBS)冲洗3遍,然后用胶原酶消化过夜后,离心去除胶原酶,后将其接种在25平方厘米的培养瓶中进行传代及细胞形态的观察。结果:(一)Alb-Cre转基因猪胚胎成纤维细胞系及其功能验证1.·载体 pAlb-Cre-PGK-GFP-T2A-PURO(pACGP)的构建及载体pCALL2-IRES-RFP(pCIR)的确认1.1载体pACGP的构建载体pACGP构建成功,经测序及酶切鉴定确定无误。1.2载体pCIR的确认载体pCIR经测序及酶切鉴定确认无误。2.pACGP及pCIR的功能验证2.1载体pCIR的整合能力的确认用质粒pCIR转染293T细胞及猪胚胎成纤维细胞PEF,48~72小时在荧光倒置显微镜下面观察未发现红色荧光及绿色荧光的表达。后进行X-gal染色,部分细胞被染成蓝色。2.2载体pCIR与Cre重组酶识别的功能验证用载体pCIR和pLⅤ-CIG共转染293T细胞及PEFs,感染72小时,在荧光倒置纤维镜下观察,发现部分细胞表达红色荧光蛋白,部分细胞表达绿色荧光蛋白,后行X-gal染色部分细胞被染成蓝色。3.利用载体pACGP及pCIR分别建立ACGP-PEFs,CIR-PEFs细胞系3.1 pACGP构建肝脏特异表达Cre猪胎儿成纤维细胞系慢病毒包装后可见90%293T细胞表达绿色荧光,后感染PEFs细胞部分细胞表达绿色荧光,后经嘌呤霉素筛选获得全阳性细胞,且经PCR确认目的基因的整合。3.2利用载体pCIR构建CIR-PEFs电转后的细胞进行X-gal染色,全部细胞被染成蓝色。(二)西藏小型猪猪耳成纤维细胞系的建立细胞形态呈长梭形,传代时间约3天。结论:(一)Alb-Cre转基因猪胚胎成纤维细胞系及其功能验证ACGP-PEFs及CIR-PEFs已建立,且功能验证符合预期,可作为体细胞核移植供体来建立肝脏特异表达Cre的西藏小型猪及评价Cre转基因猪的Z/R转基因猪。(二)西藏小型猪猪耳成纤维细胞系的建立新生猪耳成纤维细胞系基本已建立,进行进一步的传代验证。本研究的创新之处:本研究利用我单位所拥有小型猪品系,西藏小型猪及巴马小型猪来开展工作。利用转基因技术,建立了肝脏特意表达Cre胚胎成纤维细胞系以及评价Cre重组酶重组效率的转基因报告胚胎成纤维细胞系,为下一步进行体细胞核移植建立肝脏特异表达转基因克隆猪以及评价Cre重组酶重组效率的转基因报告猪提供核供体细胞。在进行转基因克隆猪与转基因猪的制备过程中,核供体细胞在体外能存活的时间以及传代的代数影响到进行鉴定以及功能验证,进行核供体细胞体外传代验证是必不可少的。而在进行体细胞核移植过程中,核供体细胞来源很多,目前常选用的是PEFs,此种细胞的获取相对比较容易,技术难度不大,但是该种细胞获得通常需要处死一头怀孕母猪作为代价,故采用猪耳成纤维细胞代替猪胎儿成纤维细胞系是对于核供体细胞来源的优化,采用猪儿成纤维细胞,如果在体外能够传代多次,是很好的替代胎儿成纤维细胞的核供体细胞。因猪耳成纤维细胞比较容易获得,符合动物福利及动物伦理的原则,简化了实验操作步骤且能想要成纤维细胞能够随时获得。