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L-鸟氨酸(L-Orn)是一种非蛋自质氨基酸,其在医药业和食品业的广泛应用使得发酵法生产Orn成为趋势。本文建立了一种快速简便的L-Orn定量方法,并对L-Orn产生菌的定向选育、摇瓶发酵条件分别进行了研究。主要结果如下:
[1]研究了发酵液中L-Orn分析方法,采用纸层析法定性、酸性茚三酮法定量。通过对发酵液纸层析法定性,可知Orn发酵液中主要含有4种氨基酸:L-Orn、L-Cit、L-hrg、L-Glu,比移值分别为0.717、0.564、0.825、0.172。酸性茚三酮法操作方法:显色液是25mg/ml茚三酮溶液,按分析液:显色液:冰乙酸=1:1:1的体积比在100℃水浴中反应60min,冷却,加适量冰乙酸,测515nm处0D值,根据L-Orn的标准曲线得发酵液中L-Orn的含量。
[2]以谷氨酸棒杆菌S9114为出发菌株,经<60>Co γ射线、NTG、U.V.多次复合诱变,最终选育出遗传稳定的L-Orn生产菌HG106-17,遗传标记为L-hrg<->+SG,在未经优化摇瓶发酵条件情况下,发酵72hr可积累L-Orn9.6mg/ml。
[3]种子培养基的最佳组成(%):葡萄糖3、硫酸铵0.6、玉米浆2ml、酵母膏1.5、K<,2>HPO<,4> 0.1、KH<,2>PO<,4>0.05、MgSO<,4>·7H<,2>O 0.04、FeSO<,4>·7H<,2>O 0.002、MnSO<,4>·7H<,2>O 0.002、pH7.0~7.2。种子培养的最佳控制条件:培养基初始pH 7.0~7.2;装液量为25ml/250ml三角瓶,棉塞封口;摇瓶转速为96rpm;培养温度为31℃左右;种龄为18hr;接种量为8%。
[4]发酵培养基的最佳组成(%):葡萄糖11、硫酸铵4、玉米浆3ml、K<,2>HPO<,4>0.1、KH<,2>PO<,4> 0.05、MgSO<,4>·7H<,2>O 0.04、FeSO<,4>·7H<,2>O 0.002、MnSO<,4>·7H<,2>O 0.002、pH 7.0~7.2、V<,B1>20 μg、D-生物素10μg、L-精氨酸15mg、CaCO<,3>2(分消)。最佳摇瓶发酵条件为:发酵培养基初始pH 7.2;装液量为25mL/250三角瓶,棉塞封口;摇瓶转速为150rpm;发酵温度为32℃;发酵周期为72hr。
本文建立的L-Orn测定方法,快速简便、准确度高。一次可测数十个样液,2hr内即可完成,特别适合菌种的诱变筛选。本文选育获得的L-Orn产生菌HG106-17遗传性状稳定,发酵产酸能力高,可做进一步的研究。