鲑鱼降钙素在链霉菌中的分泌表达

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降钙素是由32个氨基酸组成的肽类激素,在人体内调节钙磷代谢,维持内环境的稳定。降钙素最主要的功能是抑制破骨细胞的活性,保护骨骼。临床上用于治疗骨质疏松症、各种原因引起的骨骼疼痛症状、Paget’s疾病、高钙血症等。所有的动物都能产生降钙素,在人或其他哺乳动物中由甲状腺产生,在低等脊椎动物中由后鳃体产生,其中后鳃体产生的降钙素如鲑鱼、鳗鱼降钙素在人体内降钙活性比哺乳动物的降钙素高30-50倍。由于降钙素有着重要的临床使用价值和社会经济效益,我们在链霉菌表达体系中分泌表达了鲑鱼降钙素。 本文以鲑鱼总DNA为模板,用PCR方法扩增得到鲑鱼降钙素的编码序列(sCT-Gly);以含有抗生链霉菌酪蛋白酶基因的质粒pIJ702为模板,用PCR方法扩增得到了melC1的信号肽编码序列及其上游的调控序列。这两个DNA片段分别克隆到pUC19后测定了核苷酸序列,证明与已知序列相符。然后在大肠杆菌中把这两个片段连接起来,根据PCR引物的设计,这两个DNA片段连接后鲑鱼降钙素的第一个氨基酸Cys恰好位于melC1信号肽切割位点AlaArgAla↓的下游。把这个融合基因分别克隆到链霉菌载体pIJ680和pIJ459的aph启动子和ermE启动子的下游,利用这两个强启动子来分泌表达鲑鱼降钙素。用降钙素的酶联免疫测定法确定了在含有这两个重组质粒的菌株中鲑鱼降钙素得到了成功的分泌表达。对重组菌株MS680的研究发现鲑鱼降钙素的分泌表达在96小时达到最高,而胞内在24小时后降钙素水平很低,基本都分泌到了胞外。 对重组菌株MS680产生的重组鲑鱼降钙素进行了初步的纯化,发酵液离心过滤后通过大孔吸附树脂X-5,洗脱的活性峰冷干后用羧甲基纤维素CM-52阳离子交换柱纯化,降钙素的比活有了明显的提高。经高压液相色谱确定样品中主峰的保留时间与鲑鱼降钙素标准品的保留时
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