【摘 要】
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在肿瘤免疫治疗中,程序性死亡配体-1（Programmed cell death 1 ligand 1,PD-L1）是免疫检查点PD-1/PD-L1的关键蛋白。为了抑制该信号轴介导肿瘤细胞免疫逃逸,越来越多通过靶向PD-1/PD-L1信号轴的单克隆抗体被运用到癌症治疗中,并取得了一定的成效。而PD-1/PD-L1的单克隆抗体存在自身的局限性,包括不同癌症对药物敏感度不一、不易存储运输、价格昂贵等原
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在肿瘤免疫治疗中,程序性死亡配体-1（Programmed cell death 1 ligand 1,PD-L1）是免疫检查点PD-1/PD-L1的关键蛋白。为了抑制该信号轴介导肿瘤细胞免疫逃逸,越来越多通过靶向PD-1/PD-L1信号轴的单克隆抗体被运用到癌症治疗中,并取得了一定的成效。而PD-1/PD-L1的单克隆抗体存在自身的局限性,包括不同癌症对药物敏感度不一、不易存储运输、价格昂贵等原因,基于PD-1/PD-L1信号轴的小分子抑制剂为肿瘤治疗带来了新的“血液”。然而,PD-L1相关作用机制或是其表达机制尚未完全清晰,不利于其进一步临床应用;探寻与其相互作用蛋白,明确其结合位点和互作机制,为探索靶向PD-L1的小分子抑制剂提供更多信息。前期课题组利用噬菌体展示技术筛选到能与PD-L1结合的多肽D4,并根据多肽氨基酸序列在数据库中检索,得到与氨基酸序列匹配的动力蛋白激活蛋白亚基4（Dynactin 4,DCTN4）,293T细胞中过表达外源PD-L1与DCTN4的Co-IP结果显示:PD-L1与DCTN4能够在细胞内形成复合物,且DCTN4至少有两个结构域参与形成复合物。为了探究PD-L1与DCTN4是否需要中间的辅助蛋白作用形成复合物,本研究在原核生物中表达PD-L1、DCTN4及截断体蛋白,研究是否有直接结合,寻找相互作用的结构域。本课题采用大肠杆菌BL21表达体系,在p ET28a-TEV质粒中构建PD-L1、DCTN4与截断体的质粒。首先优化PD-L1、DCTN4与截断体蛋白表达、纯化系统,获得PD-L1、DCTN4与截断体蛋白后,采用免疫共沉Co-IP捕获PD-L1、DCTN4与截断体之间形成的复合物,寻找相互作用的结构域。利用等温滴定热量法（ITC）,研究PD-L1胞外区与DCTN4（1-342aa）之间的相互作用关系,量化相互作用强度。实验结果证明PD-L1与DCTN4有多个结合位点直接参与复合物的形成,与体内Co-IP结果一致。本实验在PD-L1相互作用的蛋白的基础中寻找直接结合位点,为靶向PD-L1的小分子多肽类药物的设计提供新的方向。
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