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研究背景：脓毒症最终常导致多器官功能障碍综合征(Multiple organ dysfunction syndrome, MODS),该结果已经成为当前急危重症患者的主要的死亡原因之一。肺是此过程中相关靶器官中最容易受到损伤的,感染的病理过程主要表现为急性肺损伤(Acute Lung Injury, ALI)。脓毒症的主要致病因子之一是脂多糖(lipopolysaccharide, LPS),该物质会通过直接和间接两种作用损伤肺微血管内皮细胞。细胞损伤导致肺微血管通透性增高,并发生炎症及水肿,引起ALI。微血管通透性增高,使大量液体渗透进入组织间隙中,从而进一步加剧组织细胞的缺氧状况。此外该过程中还包括炎症介质的聚集,聚集的炎症介质会释放出蛋白酶及氧自由基等有害因子,且炎症介质的聚集本身也会直接造成组织细胞的损伤。因此研究肺微血管内皮细胞损伤、肺微血管通透性的调节机制,对于寻找有效的防治脓毒症急性肺损伤的措施具有十分重要的意义。盐酸戊乙奎醚(Penehyclidine Hydrochloride, PHC),是我国原创的一种抗胆碱能药物,我国拥有其自主知识产权,其主要优势在于其对M受体有选择性。现已有研究表明,盐酸戊乙奎醚可通过抑制p38 MAPK激活,减弱iNOS的表达,减少过氧化物的产生从而明显减轻脓毒症小鼠急性肺损伤。β抑制蛋白(β-arrestins)是现在生物学中有关信号传导方面的研究中的一个热门研究对象,已经发现其与p38 MAPK激活密切相关,并有研究表明β-arrestins也可作为信号传递的脚手架蛋白,将G蛋白受体信号通路与胞内其他信号通路如TLR-ILIR通路和MAPK通路等联系起来,改变其功能或活性,以达到促进或者抑制相应通路信号传导的目的。β-抑制蛋白包括β-抑制蛋白-1 (β-arrestin-1)和β-抑制蛋白-2(β-arrestin-2)。有研究发现,缺失β-arrestin-1的小鼠胚胎成纤维细胞中MAPK活性较野生型细胞明显增强。因此,我们推测盐酸戊乙奎醚减轻急性肺损伤、保护人肺微血管内皮细胞(Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells, HPMECs)、降低细胞通透性可能和β-arrestins家族中的成员β-arrestin-1的作用有关,并以此为切入点展开实验。研究目的：本研究采用体外培养人肺微血管内皮细胞的方法,用LPS诱导细胞损伤,通过观察PHC预处理对HPMECs及转染后细胞的作用,阐明PHC在LPS诱导的HPMECs损伤中的作用,探讨β-arrestin-1与LPS诱导的HPMECs通透性改变的关系,了解PHC对HPMECs通透性的作用是否与改变β-arrestin-1的表达有关。研究方法：培养HPMECs,观察细胞生长情况及形态,并对细胞进行鉴定。鉴定后的细胞传代培养,传代4-6代的细胞用于实验。构建β-arrestin-1短发夹RNA (shRNA)表达质粒,并将空质粒和β-arrestin-1 shRNA质粒转染至正常HPMECs中。正常HPMECs分为四组：C组加入同等体积的培养基,L组加入终浓度为0.1μug/ml的LPS; PL组加入终浓度为2μg/ml PHC孵育1h后再加入终浓度为0.1ng/ml的LPS; P组加入终浓度为2μg/ml的PHC：按上述处理1h后测定各个指标；转染细胞也分为四组：NL组空质粒转染至细胞中加入终浓度为0.1μg/ml的LPS；NP组空质粒转染至细胞中加入终浓度为2μg/ml的PHC后1h再加入终浓度为0.1μg/ml的LPS; BL组：β-arrestin-1 shRNA表达载体转染至细胞中加入终浓度为0.1μg/ml的LPS; BP组：β-arrestin-1 shRNA表达载体转染至细胞中加入终浓度为2μg/ml的PHC后1h再加入终浓度为0.1μg/ml的LPS；按上述处理后孵育1h,收集细胞,检测各个指标。研究结果：1. HPMECs购自美国ScienCell公司,HPMECs在体外可稳定传代,按说明书方法进行操作,取第7代HPMECs于相差显微镜下观察,细胞株不断生长、分化后,融合呈典型铺路石样排列。此时细胞生长状态良好可用于后续实验。构建β-arrestin-1的短发夹RNA(short hairpin RNA, shRNA)表达质粒,应用shRNA设计软件设计3条shRNA的eligo DNA,构建shRNA重组质粒。采用RT-PCT法检测β-arrestin-1 mRNA,构建的质粒的表达载体可扩增出目的条带,β-arrestin-1 mRNA水平下降,提示β-arrestin-1 shRNA表达质粒构建成功,表达质粒转染成功,可用于后续实验。2.与C组比较,L组细胞,Hsp27表达量、p38 MAPK表达量、NF-κB p65表达、LDH水平均升高,β-arrestin-1表达量及I-κB表达量下降,细胞骨架破坏严重；PL组细胞结果趋势虽然整体和L组相同,但程度有所减轻；P组细胞和C组比较后,除β-arrestin-1表达量增加,其他结果差异无统计学意义；与L组比较,PL组细胞Hsp27表达量、p38 MAPK表达量、NF-κB p65表达、LDH水平均降低,β-arrestin-1表达量及I-κB表达量上升,细胞骨架破坏程度较小。3.与NL组比较,NP组细胞,Hsp27表达量、p38 MAPK表达量、NF-κB p65表达、LDH水平均降低,β-arrestin-1表达量及I-κB表达量升高,细胞骨架改变程度较小,细胞通透性降低；与BL组细胞比较,BP组细胞检测的各项指标差异无统计学意义,细胞骨架结构改变仍然明显,通透性也相似；与NP组细胞相比,BP组细胞Hsp27表达量、p38 MAPK表达量、NF-κB p65表达、LDH水平均升高,β-arrestin-1表达量及I-κB表达量下降,细胞骨架破坏严重,PMVECs通透性增高。研究结论：1. HPMECs生长状态良好,表达质粒构建成功,细胞转染成功,可用于后续实验。2.PHC对脂多糖诱导的HPMECs损伤有保护的作用,其作用可能与上调β-arrestin-1有关。3.PHC通过上调β-arrestin-1的表达对脂多糖诱导的HPMECs通透性增高有抑制作用,β-arrestin-1对于降低HPMECs通透性,减轻急性肺损伤作用重要,关系密切。