采用蛋白质工程手段对酶进行改造，使其具备特定的特性，常常是利用酶进行生物催化与生物转化的前提。课题组前期筛选到一株真菌P. purpurogenum Li-3，其表达的β-葡萄糖醛酸苷酶（PGUS）可以定向水解甘草酸（GL）生成单葡萄糖醛酸基甘草次酸（GAMG）。为了提高酶的表达量，将真菌P.purpurogenumLi-3来源的pgus在大肠杆菌中表达获得高表达重组β-葡萄糖醛酸苷酶（PGUS-E），但其键选择性降低。为了提高大肠杆菌中高效表达的PGUS-E的键选择性，本论文采用半理性设计及理性设计手段对PGUS-E进行改造，使其催化GL时具有高的键选择性，产物以GAMG为主，为利用大肠杆菌生产的β-葡萄糖醛酸苷酶(PGUS-E)进行GAMG的生物制备创造了条件。论文同时对所得的突变酶的催化性质、催化甘草酸GL的反应过程进行研究，分析了突变酶以GAMG为反应主产物的分子机制，讨论了与此相关的PGUS-E的结构-功能关系。首先，使用Pymol软件对课题组前期解析得到的PGUS-E的晶体结构（数据未发表）进行分析，发现酶的底物结合口袋由两个小口袋，其中口袋A由10个氨基酸残基组成，口袋B由15个氨基酸残基组成（包括两个催化残基）。预测口袋A与GAMG和GL末端的糖基识别相关，口袋B与GL的五环三萜相连的糖基识别相关。之后，对口袋B中氨基酸的空间构象、作用力、及极性等进行研究，保留催化残基基础上，选择了8个点进行研究，最终得到3个键选择性改善的突变株R329K，T369V，V447Q（M42），转换率达到90%以上时，键选择性分别为26.94%，34.25%，71.28%，其中尤其以M42(V447N)改善的最为明显。为了进一步提高其选择性，将T369V与V447N进行叠合突变对口袋B进行优化，获得突变酶M42-1，转化率为达到90%以上时，键选择性达到了81.78%，比M42提高了10.5%。通过理性设计将R563K与V447N进行叠合突变对口袋A、B同时优化，获得突变酶M42-2，转化率达到90%以上时，键选择性达到95.75%，比M42提高了24.47%。最后，对得到的最优突变酶pET-M42-2的酶学性质进行了考察研究，最适pH为4.5，最适温度为40℃，与PGUS-E相比没有变化。同时测定了酶学动力学参数，对GL的Km，Kcat，Kcat/Km分别为7365.214uM，10442.81min-1，1.417885uM-1min-1，对GL的亲和力下将，对GAMG的Km与Kcat检测不到，即与GAMG基本没有亲和力，对GL于GAMG的两种效应作用使β-葡萄糖醛酸苷酶键选择性提高。突变酶pET-M42-2的研究，为酶催化GL制备GAMG的工业化生成提供了基础。