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胰蛋白酶(EC3.4.21.4)是丝氨酸蛋白酶家族的一员,属于碱性蛋白水解酶类。胰液的主要成分是没有活性的胰蛋白酶原,胰蛋白酶原在肠激酶或者是有活性的胰蛋白酶的催化下,分解成为有活性的胰蛋白酶,它可以特异性的切割赖氨酸和精氨酸残基中的羧基侧链。大多数动物来源的胰蛋白酶最适温度为37℃,最适pH为8,不同物种之间有细微差异。近年来胰蛋白酶的需求量在逐步上升,在地位日益提升的酶市场中所占的比例越来越大,大概占到了年需求量的3%,迫切的需要一种新的、低成本的生产胰蛋白酶的方法。重组DNA技术为获得品质优良、价格低廉的胰蛋白酶提供了全新的渠道。本研究选用毕赤酵母表达系统来表达猪源胰蛋白酶,并对其酶学性质进行了相关的探究。之所以在众多生物中选择了猪源的胰蛋白酶来进行外源表达,这是因为与其他动物来源的胰蛋白酶对比,猪源胰蛋白酶的研究相对来说更为透彻一些。此外,据相关文献报道,猪源胰蛋白酶的活性相对其他来源的胰蛋白酶要高,并且其理化性质也相对稳定。基于这些因素,本研究选用了猪源的胰蛋白酶基因进行重组蛋白的外源性表达。本研究主要内容如下：1.基因合成：依照猪源胰蛋白酶的基因序列,合成猪源胰蛋白酶的全基因,并将该基因成功装载到pHBM905BDM载体上；2.载体构建：将重组质粒送测序,得到正确的重组质粒pHBM905BDM-Try,并构建2,3,4拷贝的Trypsin载体,分别命名为pHBM905BDM-2Try, pHBM905BDM-3Try, pHBM905BDM-4Try;3.转化酵母：将以上四种重组质粒转化毕赤酵母GS115菌株,分别得到1,2,3,4拷贝的Trypsin毕赤酵母重组子；4.摇瓶发酵：将1-4拷贝的猪源Trypsin毕赤酵母重组子进行摇瓶发酵,得到1-4拷贝猪源Trypsin的发酵上清液；5.检测表达：SDS-PAGE检测目的蛋白猪源Trypsin的表达情况,Western bolt进一步验证猪源Trypsin的表达,证明目的蛋白确已得到表达；6.纯化激活：纯化1-4拷贝的猪源Trypsin发酵上清液并浓缩,得到纯化浓缩后的Trypsin酶液,并对其进行体外激活,使其表现出了相应的酶学活性；7.酶学性质测定：对纯化浓缩后的1-4拷贝Trypsin酶液进行活性测定,最适温度及最适pH的测定,最适温度为35℃,最适pH为8.5。