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目的： PD-L1是PD-1的配体蛋白，激活PD-1后发挥负性免疫调节作用。本课题主要研究放疗直接诱导肿瘤细胞PD-L1蛋白表达机制及其表达升高后对T细胞影响。在转录水平及翻译后水平深入探讨放疗诱导PD-L1表达的分子调节机制，寻找调节PD-L1的新临床靶点。 方法： 1、在不同癌种细胞系中Western Blot检测放疗诱导PD-L1蛋白表达，选取目的细胞系，使用化学裂解法分离细胞膜、浆及核，WB检测放疗诱导PD-L1表达亚细胞水平。放疗不同剂量及时间梯度下，WB和免疫荧光法检测PD-L1蛋白表达的放疗时间及剂量依赖性。qPCR检测放疗后不同时间条件下，PD-L1mRNA表达。使用放线菌酮阻断细胞mRNA翻译过程后，检测PD-L1放疗前后表达。 2、将PC-3细胞行小剂量（0.1Gy）放疗后与Jurkat细胞共培养，WB及Annexin V-FITC/7-AAD双染法检测放疗照射PC-3细胞后共培养的Jurkat细胞PD-1/SHP-2通路激活及凋亡。使用PD-L1siRNA预先敲低PC-3细胞PD-L1表达和PD-1抗体阻断PD-L1/PD-1后再次检测共培养Jurkat的PD-1/SHP-2激活及凋亡。 3、使用ATM、ATR和PI3K抑制剂处理MDA-MB-231细胞后(8h)，qPCR检测放疗前后肿瘤细胞PD-L1mRNA表达。通过免疫沉淀法使用PD-L1抗体将放疗前后的PD-L1蛋白拉出，质谱分析PD-L1放疗相关的相互作用蛋白。 4、从质谱分析结果中，选择与PD-L1翻译后修饰可能相关靶点蛋白，使用siRNA敲低靶点蛋白，WB及qPCR检测PD-L1的表达。确定BCLAF1为PD-L1在翻译后修饰水平的调节蛋白。分别干扰AMT、BCLAF1、CMTM6及PD-L1的表达后，WB检测放疗诱导PD-L1的表达情况，确定ATM、BCLAF1、CMTM6及PD-L1之间的上下游调节关系。多细胞系验证放疗与CMTM6之间的关系。敲低BCLAF1后使用免疫沉淀将PD-L1拉出，WB检测PD-L1泛素化。 5、在美国TCGA数据库中分析33种肿瘤BCLAF1与PD-L1之间的相关性，在TCGA数据库1081例乳腺癌中，分析BCLAF1表达与乳腺癌患者生存之间的关系。在132例食管鳞癌组织(未行术前治疗)中使用免疫组化学法检测BCLAF1与PD-L1之间的相关性及分析各自与临床病例参数之间的关系。 结果： 1、放疗（5Gy，2h）可诱导MDA-MB-231、PC-3和HT1080细胞系的PD-L1蛋白表达升高，但mRNA水平无变化。在MDA-MB-231中，WB和免疫荧光检测示放疗(5Gy)后PD-L1蛋白表达2h开始升高，8h时达最高后逐渐下降。但qPCR示PD-L1mRNA水平2h、4h时无变化，在8-24h升高。放线菌酮处理后，放疗2h和4h的PD-L1表达仍升高。在不同放疗剂量下，PD-L1的表达在0.1Gy时即开始升高。分离细胞膜、浆和胞核后，WB示放疗诱导PD-L1表达升高在细胞膜。 2、将PC-3细胞行0.1Gy放疗剂量照射后与Jurkat细胞共培养24h，收集检测Jurkat细胞，WB示，放疗组SHP-2的磷酸化状态升高，Caspase-3裂解物表达升高。流式细胞仪示Jurkat细胞存活率明显低于未放疗组（55.2%VS37.9%，P<0.05）。使用PD-L1siRNA预先敲低PC-3细胞PD-L1表达和PD-1抗体阻断PD-L1/PD-1后，放疗组SHP-2的磷酸化和Caspase-3裂解物表达不再升高，放疗组与非放疗组细胞生存率差异无统计学意义（60.96%vs55.78%，P>0.05）。 3、ATR抑制剂VE-822和PI3K抑制剂LY-294002预先处理细胞后，放疗组与非放疗组PD-L1mRNA水平差别无统计学意义。ATM抑制剂处理后放疗组PD-L1mRNA水平仍升高。 4、质谱分析鉴定出102种蛋白，从中筛选出BCLAF1。敲低BCLAF1，PD-L1蛋白表达降低但其mRNA水平不降低。将ATM、BCLAF1、CMTM6和PD-L1分别敲低后，WB检测放疗后通过ATM调节BCLAF1的表达升高进而调节CMTM6表达升高，最终升高PD-L1的表达。敲低BCLAF1后，PD-L1的泛素化水平明显提高。 5、在33种癌中，24种癌BCLAF1与PDL1表达相关性具有统计学差异，且均呈正相关。在食管鳞癌中，BCLAF1胞核/浆表达率为76.5%。BCLAF1与PD-L1胞膜/浆表达呈正相关（r=0.495，P=0.000），与PD-L1胞核表达正相关（r=0.188，P=0.031）。BCLAF1与食管鳞癌临床病例特征及预后无相关性。在乳腺癌中，BCLAF1高表达与不良预后相关（P=0.000）。 结论： 1、放疗在转录水平及翻译后修饰水平均可诱导升高肿瘤细胞膜上PD-L1蛋白的表达，呈放疗时间依赖性、放疗剂量非依赖性。 2、放疗诱导的肿瘤细胞膜上PD-L1表达升高激活T细胞PD-1下游通路并进一步诱导T细胞发生凋亡。 3、放疗诱导肿瘤细胞在转录水平表达PD-L1可能通过ATR-PI3K信号转导通路介导。 4、放疗诱导肿瘤细胞在翻译后修饰水平表达PD-L1可能通过ATM-BCLAF1-CMTM6信号通路介导。BCLAF1正向调节PD-L1蛋白表达且参与了PD-L1蛋白泛素化水平调节。 5、BCLAF1表达与PD-L1表达在TCGA数据库的24种癌组织和食管鳞癌组织中呈正相关。在乳腺癌中，BCLAF1高表达与不良预后密切相关。