DNA损伤诱导肿瘤PD-L1表达相关分子调节机制研究

来源 :天津医科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:qingyun2008520
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目的:  PD-L1是PD-1的配体蛋白,激活PD-1后发挥负性免疫调节作用。本课题主要研究放疗直接诱导肿瘤细胞PD-L1蛋白表达机制及其表达升高后对T细胞影响。在转录水平及翻译后水平深入探讨放疗诱导PD-L1表达的分子调节机制,寻找调节PD-L1的新临床靶点。  方法:  1、在不同癌种细胞系中Western Blot检测放疗诱导PD-L1蛋白表达,选取目的细胞系,使用化学裂解法分离细胞膜、浆及核,WB检测放疗诱导PD-L1表达亚细胞水平。放疗不同剂量及时间梯度下,WB和免疫荧光法检测PD-L1蛋白表达的放疗时间及剂量依赖性。qPCR检测放疗后不同时间条件下,PD-L1mRNA表达。使用放线菌酮阻断细胞mRNA翻译过程后,检测PD-L1放疗前后表达。  2、将PC-3细胞行小剂量(0.1Gy)放疗后与Jurkat细胞共培养,WB及Annexin V-FITC/7-AAD双染法检测放疗照射PC-3细胞后共培养的Jurkat细胞PD-1/SHP-2通路激活及凋亡。使用PD-L1siRNA预先敲低PC-3细胞PD-L1表达和PD-1抗体阻断PD-L1/PD-1后再次检测共培养Jurkat的PD-1/SHP-2激活及凋亡。  3、使用ATM、ATR和PI3K抑制剂处理MDA-MB-231细胞后(8h),qPCR检测放疗前后肿瘤细胞PD-L1mRNA表达。通过免疫沉淀法使用PD-L1抗体将放疗前后的PD-L1蛋白拉出,质谱分析PD-L1放疗相关的相互作用蛋白。  4、从质谱分析结果中,选择与PD-L1翻译后修饰可能相关靶点蛋白,使用siRNA敲低靶点蛋白,WB及qPCR检测PD-L1的表达。确定BCLAF1为PD-L1在翻译后修饰水平的调节蛋白。分别干扰AMT、BCLAF1、CMTM6及PD-L1的表达后,WB检测放疗诱导PD-L1的表达情况,确定ATM、BCLAF1、CMTM6及PD-L1之间的上下游调节关系。多细胞系验证放疗与CMTM6之间的关系。敲低BCLAF1后使用免疫沉淀将PD-L1拉出,WB检测PD-L1泛素化。  5、在美国TCGA数据库中分析33种肿瘤BCLAF1与PD-L1之间的相关性,在TCGA数据库1081例乳腺癌中,分析BCLAF1表达与乳腺癌患者生存之间的关系。在132例食管鳞癌组织(未行术前治疗)中使用免疫组化学法检测BCLAF1与PD-L1之间的相关性及分析各自与临床病例参数之间的关系。  结果:  1、放疗(5Gy,2h)可诱导MDA-MB-231、PC-3和HT1080细胞系的PD-L1蛋白表达升高,但mRNA水平无变化。在MDA-MB-231中,WB和免疫荧光检测示放疗(5Gy)后PD-L1蛋白表达2h开始升高,8h时达最高后逐渐下降。但qPCR示PD-L1mRNA水平2h、4h时无变化,在8-24h升高。放线菌酮处理后,放疗2h和4h的PD-L1表达仍升高。在不同放疗剂量下,PD-L1的表达在0.1Gy时即开始升高。分离细胞膜、浆和胞核后,WB示放疗诱导PD-L1表达升高在细胞膜。  2、将PC-3细胞行0.1Gy放疗剂量照射后与Jurkat细胞共培养24h,收集检测Jurkat细胞,WB示,放疗组SHP-2的磷酸化状态升高,Caspase-3裂解物表达升高。流式细胞仪示Jurkat细胞存活率明显低于未放疗组(55.2%VS37.9%,P<0.05)。使用PD-L1siRNA预先敲低PC-3细胞PD-L1表达和PD-1抗体阻断PD-L1/PD-1后,放疗组SHP-2的磷酸化和Caspase-3裂解物表达不再升高,放疗组与非放疗组细胞生存率差异无统计学意义(60.96%vs55.78%,P>0.05)。  3、ATR抑制剂VE-822和PI3K抑制剂LY-294002预先处理细胞后,放疗组与非放疗组PD-L1mRNA水平差别无统计学意义。ATM抑制剂处理后放疗组PD-L1mRNA水平仍升高。  4、质谱分析鉴定出102种蛋白,从中筛选出BCLAF1。敲低BCLAF1,PD-L1蛋白表达降低但其mRNA水平不降低。将ATM、BCLAF1、CMTM6和PD-L1分别敲低后,WB检测放疗后通过ATM调节BCLAF1的表达升高进而调节CMTM6表达升高,最终升高PD-L1的表达。敲低BCLAF1后,PD-L1的泛素化水平明显提高。  5、在33种癌中,24种癌BCLAF1与PDL1表达相关性具有统计学差异,且均呈正相关。在食管鳞癌中,BCLAF1胞核/浆表达率为76.5%。BCLAF1与PD-L1胞膜/浆表达呈正相关(r=0.495,P=0.000),与PD-L1胞核表达正相关(r=0.188,P=0.031)。BCLAF1与食管鳞癌临床病例特征及预后无相关性。在乳腺癌中,BCLAF1高表达与不良预后相关(P=0.000)。  结论:  1、放疗在转录水平及翻译后修饰水平均可诱导升高肿瘤细胞膜上PD-L1蛋白的表达,呈放疗时间依赖性、放疗剂量非依赖性。  2、放疗诱导的肿瘤细胞膜上PD-L1表达升高激活T细胞PD-1下游通路并进一步诱导T细胞发生凋亡。  3、放疗诱导肿瘤细胞在转录水平表达PD-L1可能通过ATR-PI3K信号转导通路介导。  4、放疗诱导肿瘤细胞在翻译后修饰水平表达PD-L1可能通过ATM-BCLAF1-CMTM6信号通路介导。BCLAF1正向调节PD-L1蛋白表达且参与了PD-L1蛋白泛素化水平调节。  5、BCLAF1表达与PD-L1表达在TCGA数据库的24种癌组织和食管鳞癌组织中呈正相关。在乳腺癌中,BCLAF1高表达与不良预后密切相关。
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