研究背景：原发性肝细胞癌(Hepatocellular Carcinoma, HCC)是一种恶性程度高、进展快、预后差的肿瘤。HCC作为最常见的恶性肿瘤之一,大部分患者诊断时已处于疾病的中晚期,失去手术治疗的机会,并且具有侵袭性强、易复发转移等特性,给治疗带来了困难。虽然目前对肝癌的诊疗水平有所提高,但治疗效果仍不十分理想。由于其较高的病死率、有限的治疗手段以及复杂的发病机制,使肝癌的防治成为世界性的难题。HCC呈全世界性分布,发病率因地区而异,我国、东南亚和非洲等地区均是高发地区。目前普遍认为HCC的发生是多种因素共同作用的结果,这些因素包括病毒、寄生虫感染、黄曲霉素的摄入和自身遗传因素等。其中乙型肝炎病毒(HBV)感染与HCC的发生密切相关,就全球范围来讲,HBV慢性感染仍然是HCC最重要的病因。我国是HBV感染的高发地区,全国估计有近1亿慢性HBV感染者,HBV感染是引起我国肝癌高发病率的主要原因,但其致病机制尚不十分清楚。肝癌的发生是多种因素共同作用的结果,其过程涉及一系列的分子事件,包括多个基因及多条细胞信号转导通路的改变。而蛋白激酶(Protein Kinase, PK)在信号转导中发挥着重要的作用,其稳定和成熟需要分子伴侣蛋白的帮助。热休克蛋白90(Heat shock protein90, HSP90)是最为重要的一种分子伴侣,其发挥作用的过程中需要多种辅助分子伴侣的共同参与,其中CDC37(Cell Division Cycle, CDC37)是最重要的辅助分子伴侣之一CDC37分子可作为辅助分子伴侣,特异性地介导多种蛋白激酶与HSP90的结合,对维持蛋白的稳定性和激酶活性有重要意义,在细胞周期、信号转导和基因表达中都起着重要的作用,并且与肿瘤的发生发展密切相关。研究表明,CDC37可在多种肿瘤细胞中过表达,而将其作为靶点抑制它的表达可同时抑制多条信号通路,能更有效地抑制肿瘤细胞的生长。目前有关CDC37与肝癌方面的研究较少,部分研究表明其可在肝癌细胞中表达增高,本文通过研究进一步明确CDC37在HBV相关肝癌组织中的表达情况,并希望从不同角度探讨CDC37在HBV相关肝细胞癌中过表达的机制,为肝癌的防治提供参考。研究目的：我们前期及本文的研究发现CDC37在HBV相关肝癌组织中过表达,本研究拟从病毒及宿主两方面对CDC37在HBV相关HCC中过表达的机制进行探讨,为HCC的防治及明确CDC37在其它肿瘤中过表达的机理提供参考。1、采用Wsetern的方法对CDC37在HBV相关HCC患者的肝癌组织及癌旁组织中表达情况进行分析,以进一步明确其是否在HCC中过表达,以便下一步对其过表达的机制进行探讨。2、研究HBV的复制和不同基因的表达是否会影响肝细胞内CDC37的表达水平,从而促进肝癌的发生发展。3、通过分析不同nicroRNA对CDC37基因mRNA3’UTR荧光素酶报告基因活性的影响,探讨相应microRNA是否与CDC37过表达有关。4、探讨CDC37基因启动子区微卫星的不同组成形式是否与CDC37基因过表达相关。研究方法：1、采用Wsetern的方法对CDC37在HBV相关HCC患者的肝癌组织及癌旁组织中表达情况进行分析收集南方医院2012-2013年42例HBV相关HCC患者手术后组织标本,分别留取其肿瘤及癌旁正常肝组织,提取组织蛋白,用Western blot方法分析CDC37蛋白在HBV相关HCC患者的肝癌组织及癌旁组织中的表达情况,并进一步分析CDC37的表达与临床病理特征的关系。2、HBV的复制和不同基因的表达对CDC37表达水平的影响首先扩增HBV6种基因P、preS1、preS2、S、C和X,并构建至pCMV表达载体,分别转染Huh7和HepG2细胞系,Western blot检测CDC37表达水平；另外将含CDC37基因启动子序列的荧光素酶报告质粒pGL3与HBV的6种基因表达质粒分别共转染Huh7和HepG2细胞系,检测荧光素酶信号。其次分别构建B、C、D和CD重组体4种HBV基因型毒株的1.28拷贝全基因质粒,运用AdEasy腺病毒系统进行重组和包装后分别感染Huh7和HepG2细胞系,并检测CDC37表达水平。3、调控CDC37表达的microRNA(1)调控CDC37基因表达的microRNA基因克隆：分别用miRBase, Targetscan, miRanda以及RNA22软件对可能调控CDC37表达的nicroRNA分子进行了预测,并用合成的microRNA前体分子与克隆有CDC37基因mRNA的3’UTR的载体pMIR-REPORT分别共转染Huh7, HepG2以及293T细胞,对预测的可能调控CDC37表达的microRNA分子进行筛选。本研究中我们首先扩增了5种可能影响CDC37表达的microRNA分子miR-155、miR-503、miR-877、miR-885和miR-181, PCR产物纯化后用Kpn I和Xba I双酶切,再与经同样酶切的pcDNA3.1载体连接并转化至JM109感受态细胞。对经过初步鉴定的阳性克隆提取质粒并进行酶切,测序证实扩增序列的正确性。构建的microRNA表达质粒分别命名为pcDNA3.1-MIR155、pcDNA3.1-MIR181pcDNA3.1-MIR503、pcDNA3.1-MIR877、pcDNA3.1-MIR885。(2) pMIR-Luc-Cdc37表达载体的构建：提取肝组织总RNA,逆转录为cDNA,PCR扩增CDC37基因mRNA的3’UTR, PCR产物纯化后用Spe I和HindⅢ双酶切,再跟经同样酶切的pMIR-REPORT荧光素酶报告载体(Ambion公司)连接并转化至JM109感受态细胞。对经过初步鉴定的阳性克隆提取质粒并进行酶切、测序鉴定。(3)细胞转染：采用脂质体转染法将上述5种microRNA重组表达质粒和pMIR-Luc-Cdc37表达质粒共转染48孔板中的Hu7和293细胞,阴性对照为pcDNA3.1空载体,用pRL-TK质粒作为内参平衡不同孔之间的转染效率。(4)转染效果的测定：转染48小时后裂解细胞检测荧光素酶信号,以验证哪种microRNA对CDC37基因具有抑制作用,从而明确哪种microRNA可调控CDC37基因的表达。4、CDC37基因启动子区微卫星的不同组成形式与过表达的关系对22例接受肝脏手术的肝癌患者,分别提取癌组织和癌旁组织中的基因组DNA, PCR法扩增CDC37基因启动子区含微卫星区段序列,并克隆至PMD-18T载体,每份标本至少挑选3个以上克隆进行测序,然后对肝癌组织和癌旁组织间、CDC37过表达的肝癌组织与相应的癌旁组织间、CDC37过表达和无过表达的肝癌组织间启动子GT微卫星多态性组成形式进行比较分析。结果：1、CDC37在HBV相关HCC患者的肝癌组织及癌旁组织中表达情况经western分析和对相应条带灰度值的计算结果表明,肝癌组：中位数为338.53,癌旁组：中位数为133.39,两组间差异有统计学意义(P<0.05)。比较肝癌不同临床病理特征分组中CDC37蛋白的表达情况显示,CDC37蛋白的高表达与性别、年龄、肿瘤大小、分化程度、肿瘤分期、肿瘤转移情况无关(P>0.05),与肿瘤结节数有关(P<0.05)。2、HBV的复制和不同基因的表达对CDC37表达水平的影响基因表达结果显示,HBV6种基因的表达对肝癌细胞系内CDC37的表达水平无明显影响,而且HBV6种不同蛋白的表达对CDC37启动子的活性无明显影响。1.28拷贝HBV全基因质粒的感染结果显示,HBV不同基因型毒株的复制对CDC37基因的表达水平亦无明显影响。3、不同microRNA表达载体对CDC37报告基因荧光素酶活性的影响本研究成功构建了5种nicroRNA表达质粒,与CDC37报告基因共转染Huh7细胞和293细胞后,荧光素酶检测结果显示,转染各microRNA重组表达质粒的孔中相应荧光素酶比值与阴性对照孔相比,并无显著下降,说明相关microRNA干扰质粒对CDC37基因并无明显抑制作用。4、CDC37基因启动子区微卫星的不同组成形式与过表达的关系CDC37基因启动子区存在(GT) nl-GC-(GT) n2多种类型的微卫星形式,位于CDC37启动子区约1368-1415位之间,以(GT)10-GC-(GT)9最为常见。肝癌组织和癌旁组织间CDC37启动子微卫星多态性形式的总体分布之间没有统计学差异(P>0.05)；CDC37过表达的肝癌组织与相应的癌旁组织间微卫星的总体分布也无统计学差异(P>0.05)；而CDC37过表达和无过表达的肝癌组织间微卫星的总体分布存在统计学差异(P<0.05),其中(GT)10-GC-(GT)9形式在过表达组中的频率显著高于无过表达组,差异有统计学意义(χ2=11.508, P<0.05),(GT)10-GC-(GT)12形式在无过表达组中所占比例明显高于过表达组,差异有统计学意义(χ2=15.055,P<0.05)结论：1、经Western方法对肝癌及相应癌旁正常组织CDC37蛋白含量的检测表明,CDC37在HBV相关HCC中过表达。2、HBV的复制和不同基因的表达不会明显影响CDC37的表达水平。提示HBV的复制和不同蛋白的表达不会通过上调肝细胞内CDC37的表达水平而导致HCC的发生。3、本研究未筛选到调控CDC37基因表达的nicroRNA, CDC37基因的表达是否存在microRNA调控有待明确。4、CDC37基因启动子区存在微卫星多态性,但不同的微卫星组成形式是否会影响基因的表达尚待进一步研究。