肝纤维化是各种病因所致的慢性肝病的共同病理过程,是向肝硬化发展的主要中心环节。随着对细胞生物学及生物化学的深入的研究,认为肝纤维化的形成是慢性肝损伤过程中多种细胞密切联系,并通过多种细胞因子及细胞外基质蛋白等相互作用、相互影响组成的网络来调控,其中肝星状细胞(HSC)的激活是核心事件。　　 近十年,对肝星状细胞的研究已经成为研究热点,并随着分子生物学技术的不断发展,对其研究有了更深的认识。通过对抗氧化应激、抑制炎症反应、调节相关细胞因子的活性、干扰细胞因子信号转导等途径抑制HSC增殖活化、诱导HSC凋亡,均可呈现一定的抗纤维化作用。目前,对肝纤维化的治疗主要从几点出发:(1)去除病因治疗。肝损伤严重的部位通常会产生纤维化,而炎症和损伤的严重程度与肝纤维化成正相关,如果早一步去除病因,如病毒、酒精及毒物,这是预防肝硬化最有效的治疗措施。(2)抑制肝星状细胞的激活和增生。(3)增加肝脏细胞外基质(extra cellular matrix,ECM)的降解。如基质金属蛋白酶及其抑制剂TIMP,或使用尿激酶型纤溶酶原激活剂及其抑制剂。(4)增强肝细胞再生。如肝细胞生长因子(HGF)不仅能刺激肝脏再生,还能阻止肝纤维化的发生并加速其恢复。(5)干细胞治疗。已有研究证实间充质干细胞(MSC)能够通过诱导HSC凋亡起到减轻肝纤维化作用。虽然,以上药物在治疗肝硬化过程中有效,但是副作用也大,如肝细胞生长因子有致肿瘤的危险,而尿激酶型纤溶酶原激活剂及其抑制剂可能会引起出血或是血栓形成。Kawada等人在对大鼠的肝星状细胞进行了蛋白质组研究,发现了一种新蛋白,此蛋白在各种组织中广泛表达,其中以心脏、胃、膀胱和小肠显著,目前命名为细胞珠蛋白(Cytoglobin,Cygb)。　　 Cygb是一种细胞质和细胞核蛋白质,存在于正常动物和人的内脏组织中,但在活化的星状细胞中表达明显上调。NaKatani等人报道,Cygb存在于大多数内脏器官,但只位于星状细胞和纤维样细胞中,即维生素A储存细胞中。维生素A储存细胞是一种以含脂滴为特征的细胞。在哺育动物中,除肝纤维样细胞外,胰腺、肺、小肠、肾脏中也含有维生素A储存细胞。因此,推测Cygb可以作为维生素A储存细胞的标志物并且与肝纤维化的形成有关,但具体作用机制不明。　　 有关Cygb的具体作用,目前仅有少量研究。有文献报道,Cygb在低氧情况下表达量增加,说明Cygb是一种保护性蛋白。有研究表明,Cygb具有抗肿瘤的作用。还有研究显示HSC中过表达Cygb具有缓解氧化应激,抑制星状细胞的活化,进而具有抗纤维化的作用。　　 全世界有超过5％以上的人口患有与肝硬化相关的疾病,在许多国家肝硬化已经成为一种较普遍的致死病因。肝纤维化是各种损害因素导致的肝细胞发生炎症坏死,肝内纤维结缔组织异常增生。肝纤维化是慢性肝损伤向肝硬化发展的动态过程。积极探索肝纤维化发病机制,寻求有效治疗措施对降低肝硬化发病率和死亡率具有重要意义。目前,本实验室用重组的细胞珠蛋白应用到肝纤维化模型的大鼠体内,发现细胞珠蛋白有治疗肝纤维化的作用,并且疗效显著。细胞珠蛋白作为一种源于人体大部分内脏器官的正常蛋白,作为候选生物制品药物,其毒副作用小,但其药理作用和药代动力学还不甚清楚。本研究的目的是制备抗rhCygb单克隆抗体,并建立双抗体夹心检测方法,为下一步研究其药代动力学奠定基础及建立一种药物定标的方法。　　 本研究通过采用本实验室已构建好的工程菌制备rhCygb,并通过分子筛进行初步纯化以及进行复性,阴离子交换层析方法进行再纯化,通过SDS-PAGE电泳检测蛋白的纯度。用纯化好的蛋白与完全弗氏佐剂1:1混合进行小鼠第一次免疫,皮下多点注射,两周后用纯化好的蛋白与不完全弗氏佐剂1:1混合,腹腔注射进行第二次免疫,10天后通过间接ELISA检测效价,效价达1:10000时进行细胞融合,融合前三天进行加强免疫。利用甲基纤维素半固体培养基法制备单克隆抗体,通过间接ELISA法筛选阳性细胞的单克隆抗体,体外连续培养10代,冻存复苏后仍为阳性者为单克隆抗体阳性细胞株。通过抗原表位相加法筛选单克隆抗体的表位,选取不同表位单克隆抗体在体外大量制备抗体,间接ELISA测定其效价,抗体亚型试剂盒测定抗体的亚型,通过间接ELISA和Westernblot鉴定其特异性,将单抗分别用HRP标记,计算标记率和抗体浓度,然后进行两两配对,通过抗体配对实验确定最佳配对抗体,方阵滴定法确定包被抗体和酶标抗体的最佳浓度,以纯化的rhCygb为抗原建立标准曲线,以回收率、精密度和灵敏度评价ELISA方法。初步建立一种检测Cygb蛋白的ELISA方法,该方法的建立可以对rhCygb蛋白的药代动力学进行研究,并且可以对rhCygb蛋白药物定标。　　 结果显示,本实验成功表达和纯化了rhCygb,其纯度达到了电泳纯度。用纯化的重组蛋白免疫小鼠制备免疫血清,经间接ELISA法显示免疫血清可以和重组蛋白特异性结合,且效价较高,而正常小鼠血清与重组蛋白无反应。待免疫小鼠血清效价达到1:12800,将免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞融合,使用甲基纤维素半固体培养基法并通过间接ELISA法获得了15株阳性单克隆抗体细胞株。通过抗原表位相加法实验,获得五株表位不同的细胞株,通过Western Blotting验证能与rhCygb特异性结合,间接ELISA不与本实验室制备的其它PET28a-BL21蛋白及BL21裂解液发生交叉反应。本方法灵敏度为1.25ng/ml,在浓度为10～1250ng/ml范围线性关系良好,相关性达0.9931,分析内和分析间平均变异系数分别为6.2％和10.92％。5％BSA稀释其平均回收率为105.12％；5％脱脂奶粉稀释平均回收率为101.12％；用100℃加热1min的20％小牛血清稀释,平均回收率为89.03％；而用正常20％小牛血清,平均回收率为55.3％。　　 以上结果表明,本实验建立了一种用于检测rhCygb蛋白双抗体夹心ELISA法。实验的关键在于获得两株亲和力高、特异性强且识别不同抗原表位的单克隆抗体,这就需要获得多株单克隆抗体,而我们选用了甲基纤维素半固体培养基的方法,此种方法所需的时间短而且获得的单克隆细胞株多。通过此方法,本实验获得了两株最佳配对抗体,并不断的摸索和优化实验条件,最后建立了检测重组人源细胞珠蛋白的双抗体夹心方法。实验内和实验间变异分别为6.2％和10.92％,均符合批内变异系数小于10％、批间变异系数小于15％的范围,并且通过高浓度的BSA稀释仍具有高回收率,然而用正常小牛的血清稀释蛋白,发现回收率较低,原因可能是正常血清中有物质与rhCygb结合,影响了抗原构象,从而不能很好的用双抗体夹心方法捕获。而rhCygb作为一种生物活性蛋白,或许正是通过作用于血中的某些促进纤维化作用的物质如血小板源性生长因子、转录生长因子等反应而发挥作用的,但这种猜想需进一步证实。　　 目前,国内外尚未见此方法的报道。该方法的建立可以对rhCygb蛋白的药代动力学进行研究,并且可以建立一种精确的药物定标的方法及可起到监测血药浓度的作用,这给调整给药方案提供了参考依据,对rhCygb作为治疗肝纤维化药物的研发具有重要作用,具有一定学术价值和潜在应用价值。