研究背景和目的视网膜色素变性（Rentinitis pigmentosa,RP,OMIM:268000）是光感受器细胞（包括视杆细胞和视锥细胞）异常而导致的遗传性视网膜疾病。RP在世界范围内的发病率约为1/5000-1/3500;在我国,RP的发病率也在逐年上升,约为l/l000,是引起失明的重要原因之一。根据是否同时伴随其他眼部症状,RP可以分为综合征型视网膜色素变性（Syndromic retinitis pigmentosa）和非综合征型视网膜色素变性（Nonsyndromic retinitis pigmentosa,NSRP）,其中NSRP约占RP的65%。RP的发病机制异常复杂,涉及多种不同的生物代谢途径。其致病基因所编码的蛋白主要参与光传导、感光细胞结构的维持以及m RNA剪接等过程。不同生物途径中各种蛋白的编码基因突变而使蛋白功能受损,都可能导致光感受器细胞的异常,引起RP的发生。2012年,许菲等在一个常染色体显性遗传RP家系的研究中发现PRPF31基因的7号外显子上有一个c.544₆18del75bp的新发突变。但是,许菲等的研究选取的家系并不完整,只是该家族大家系中的一小部分;另外由于RP具有极强的临床和遗传异质性,可能存在新的尚未发现的致病突变位点;并且许菲等的研究没有对该c.544₆18del75bp缺失突变具体机制和功能进行深入探索。因此,我们对该家系进行补充和完善,对许菲的研究结果在整个大家系中进行验证,同时寻找新的致病突变,进一步阐明基因型和表型的关系,并对c.544₆18del75bp缺失突变的功能进行初步研究,为RP的分子遗传机制及临床诊断和治疗提供理论依据。研究对象对许菲等研究的RP家系进行补充和完善,并对该家系成员进行了详细的病史采集和眼科检查,对家系内患者进行了确诊。详细了解该家系成员的信息后绘制家系系谱。抽取该家系成员外周静脉血5mL。此外,随机选取100名健康个体作为正常对照,抽取外周血5mL。本研究通过了郑州大学伦理委员会的审批,所有受试者均知情同意。研究方法1.本研究采用全血基因组提取试剂盒提取了外周血基因组DNA,对该RP家系成员提取了RNA,并反转录成cDNA。2.对该家系中全部成员和100名健康对照通过sanger测序进行PRPF31基因c.544₆18del75bp突变位点的测序筛查验证,鉴定该基因型与表型在家系中的共分离。并且对家系内患者的基因组cDNA进行c.544₆18del75bp突变位点的sanger测序验证。3.对该突变位点进行生物信息学功能分析,并通过SWISS MODEL软件预测野生型和突变型PRPF31基因编码蛋白的三维结构。4.采用实时荧光定量RT-PCR技术检测该家系中患者和正常人的外周血中PRPF31基因mRNA的表达水平。构建携带野生型和突变型PRPF31基因的过表达载体并采用质粒提取试剂盒进行提取和纯化,其后转染293T细胞,通过Western blot检测野生型和突变型基因编码蛋白在293T细胞内是否有表达。运用RT-PCR技术在转染野生型和突变型过表达载体的293T细胞中检测PRPF31基因mRNA的表达水平,验证突变对PRPF31基因功能的影响。5.通过查阅文献及The Human Protein Atlas数据库筛选和mRNA剪切相关并且在人类外周血中有表达的RP9、ROM1、SNRNP200和TOPORS等基因。运用实时荧光定量RT-PCR技术在该家系患者和正常人的外周血中检测这些基因mRNA的表达水平,并在转染野生型和突变型过表达载体的293T细胞中验证这些基因的表达情况。6.采用SPSS21.0统计软件进行数据分析。家系内患者与健康对照之间mRNA的表达水平采用独立样本t检验进行统计分析,所有定量资料用均数±标准差（mean±SD）表示,运用Bivariate相关性分析,对家系内所有成员中PRPF31基因的mRNA表达水平与其相关基因的mRNA表达水平分别进行相关性分析。P<0.05具有统计学意义。结果1.该家系内大部分患者都在10岁前发病,均以夜盲为首发症状,伴有视力有下降、视野缺损等症状,眼底检查表明视盘颜色相对正常,但有不同程度的视网膜色素细胞萎缩。2.经过sanger测序发现所有患者的DNA和cDNA中都携带有PRPF31基因c.544₆18del75bp突变。除1例外显不全成员外,家系内正常人和100例健康对照中则没有检测到该突变。本研究结果与许菲等人的研究结果一致。此外,我们在PRPF31基因上发现了一个IVS6-78_IVS6-75del4CACA的缺失突变,但所有患者中均未发现该突变。这两个缺失突变同时存在于家系中的1例外显不全的成员中,并且位于不同的染色体上。家系内正常人中IVS6-78_IVS6-75del4CACA缺失突变发生率为31.4%,且都为杂合突变。100例健康对照有38%的人有IVS6-78_IVS6-75del4CACA突变并且均为杂合突变,其等位基因的频率为21.5%。3.利用SWISS MODEL对c.544₆18del75bp突变型PRPF31基因所编码的蛋白进行三维结构的预测,结果提示蛋白的结构发生了比较明显的缺失改变。利用Mutation Taster在线软件对PRPF31基因上的c.544₆18del75bp突变位点和IVS6-78_IVS6-75del4CACA突变位点进行功能预测,结果显示c.544₆18del75bp缺失是一种致病突变,能够造成氨基酸序列的改变和剪切位点的改变,进而可能造成蛋白质结构的改变。而IVS6-78_IVS6-75del4CACA位点能够使剪切位点发生改变,可能改变蛋白质的结构。4.通过实时荧光定量RT-PCR技术在家系内16例患者与26例正常对照之间对PRPF31基因mRNA表达水平进行比较,发现患者外周血中PRPF31基因的mRNA表达水平（0.65±0.40）显著低于正常对照（1.35±1.15）,差异有统计学意义（P<0.05）。构建携带野生型和突变型PRPF31基因的过表达载体并转染293T细胞后,Western blot检测到突变型和野生型PRPF31的过表达载体在293T细胞内能够正常表达,采用实时荧光定量RT-PCR检测PRPF31基因的mRNA表达水平,发现野生型和突变型PRPF31基因转染组PRPF31基因mRNA表达水平显著高于阴性对照组（P<0.001）,且野生型PRPF31基因的mRNA表达水平显著高于突变型（P<0.001）。5.采用实时荧光定量RT-PCR在家系内16例患者与26例正常对照之间检测RP9、ROM1、SNRNP200和TOPORS等基因的mRNA的表达水平,发现患者外周血中RP9和ROM1基因mRNA的表达水平（分别是0.52±0.34和0.79±0.67）显著低于正常对照（分别是1.50±1.13和1.74±1.72）,差异有统计学意义（P<0.05）。运用Bivariate相关性分析,对家系内39例成员（16例患者与26例正常对照者）的PRPF31基因的mRNA表达水平与RP9、ROM1基因的mRNA表达水平分别进行相关性分析,结果显示:PRPF31基因与RP9基因的mRNA表达水平呈显著的正相关（r=0.71,P=0.000）。在转染后的293T细胞中对RP9、ROM1、SNRNP200和TOPORS基因的表达水平进行体外验证,发现突变型PRPF31转染组中RP9的表达水平低于野生型转染组,但是差异没有统计学意义。结论1.PRPF31基因的杂合突变c.544₆18del75bp可能是该视网膜色素变性家系的致病突变,而IVS6-78_IVS6-75del4CACA缺失突变可能是一个多态位点。2.PRPF31基因c.544₆18del75bp致病突变能够降低该基因的mRNA表达水平,这可能是PRPF31基因c.544₆18del75bp突变导致RP发生的重要机制。3.PRPF31基因c.544₆18del75bp突变能够使ADRP相关基因RP9的表达水平显著降低,表明PRPF31基因的c.544₆18del75bp突变可能通过影响RP9的正常功能导致RP的发生。