第一部分S0X8在非小细胞肺癌组织中的表达及临床病理学研究目的原发性肺癌是全世界最为常见的恶性肿瘤,并位居因肿瘤致死病因的首位,由于高恶性程度及高发病率,在全球范围内给各国带来了沉重的医疗负担。其中,非小细胞型肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)占所有原发性肺癌的85%。越来越多的证据显示SOX蛋白在肿瘤发展和肿瘤干细胞维持方面起着关键性作用。尽管SOX8和SOX9同属于SOX蛋白家族的E群,但是目前肿瘤方面的研究主要集中在SOX9蛋白上,并在多种肿瘤组织进行了探索,其中也包括了NSCLC。考虑到SOX8和SOX9在胶质瘤组织和肝细胞性肝癌组织中同时存在过度表达的现象,因此决定对目前在NSCLC上所知甚少的SOX8进行研究。本部分主要内容为表观性水平上,运用免疫组织化学和实时荧光定量多聚酶链反应实验方法对SOX8基因在80例INSCLC病理样本中蛋白质和mRNA水平上的表达进行研究,并对SOX8蛋白质表达与相关临床指标之间的关系进行研究。同时,为明确SOX8对于NSCLC患者预后的指导意义,我们对其中的77例患者进行了随访。方法1.应用免疫组织化学检测NSCLC组织80例及正常支气管肺组织7例(距原发肺癌组织边缘>5 cm)中SOX8在翻译水平上蛋白质的表达。同时对SOX8蛋白质与NSCLC包括患者年龄、性别、NSCLC细胞分化状况、淋巴结转移和临床分级等临床病理指标进行相关性分析。2.运用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)对NSCLC组织和正常支气管肺组织中SOX8在转录水平上mRNA的表达。3.对随访资料齐全的77名NSCLC患者进行随访,并根据免疫组织化学结果将患者分为SOX8过度表达组和SOX8低表达组,并对SOX8表达对患者生存时间的影响进行单因素生存分析(Log-rank分析)。结果1.SOX8蛋白质在非小细胞肺癌和正常肺组织中的表达在翻译水平上通过免疫组织化学检测显示,正常肺组织中没有发现SOX8蛋白质的表达,而在NSCLC中有过度表达(P<0.01)。SOX8以细胞核着色为主,仅有散在的细胞质着色。其中,NSCLC中SOX8总阳性(率)为86.25%(69/80),而强表达数占62.5%(50/80)。2.SOX8表达与NSCLC与临床病理因子之间的关系为进一步探讨SOX8表达在NSCLC上的意义,我们分析了SOX8与患者临床参数之间的相关关系(表1-1)。结果显示,SOX8的表达程度与肿瘤体积(P<0.001)、淋巴结转移(P=0.001)、不同分化程度(P=0.015)和临床分级(P=0.013)相关。与之相反,SOX8基因与组织分型、性别和饮酒／吸烟史无关。同时,年龄对SOX8基因的表达也无影响。3.SOX8在非小细胞肺癌和正常肺组织中的mRNA表达为研究SOX8在NSCLC组织和正常肺组织中转录水平上的表达情况,我们采取qRT-PCR方法进行。结果显示,在转录水平上通过qRT-PCR检测,单因素方差分析结合Tukey’s post hoc检验显示,中低分化NSCLC (11.71倍,P<0.001)和高分化NSCLC(6.52倍,P＝0.047)中SOX8基因的表达显著高于正常支气管肺组织。同时中低分化NSCLC中SOX8基因的表达显著高于高分化NSCLC(1.80倍,P<0.001)。4.SOX8蛋白质表达与NSCLC患者预后的关系Log-Rank单因素生存分析显示,SOX8蛋白高表达组患者(36.5个月,n=28)术后生存时间显示短于低表达组患者(48.7个月,n＝49,P=0.006)。结论1.SOX8在正常支气管肺组织中未观察到明显表达。2.SOX8在NSCLC中高度表达,同时与肿瘤体积、分化程度、淋巴结转移和临床分级存在显著的相关关系。SOX8可能与NSCLC细胞的增殖性和侵袭性存在某种相关关系。3.在NSCLC患者中,SOX8高表达组的预后显著差于低表达组,提示SOX8表达程度可以作为临床判断NSCLC的有效指标。第二部分miRNA-124治疗非小细胞型肺癌的体外研究目的微小RNA (microRNA, miRNA)又被称作小分子RNA,是一种真核生物中普遍存在的RNA分子,其长度约为19至25个核苷酸。尽管序列很短,但是miRNA可以和目标mRNA结合,在转录后水平上抑制基因的表达,从而起到调控基因表达的作用。因此miRNA通过与目标mRNA的调节作用,起到肿瘤抑制或者癌基因的作用,因此针对miRNA的功能,可以使之成为一种新型的肿瘤治疗手段方法。但是目前关于非小细胞型肺癌中SOX8蛋白的调控miRNA仍未见报道。在本部分将通过TargetScan等软件预测可能的miRNA,并验证该miRNA即miRNA-124与SOX8基因间的相互作用关系以及miRNA-124过表达及抑制剂对NSCLC细胞系增殖和迁移的影响。方法1.利用公众专业检索软件对SOX8基因的调节性miRNA进行预测利用TargetScan, MicroCosm Targets version 5和microRNA. org数据库对SOX8可能的上游效应miRNA进行了预测及SOX8 3’UTR可能与miRNA的结合位点2.检测NSCLC组织和正常肺组织中miRNA-124的表达情况利用qRT-PCR检测miRNA-124在NSCLC组织中miRNA-124的表达情况并进行比较。3.对miRNA-124与SOX8相互作用进行验证验证方法为扩增包含SOX83’UTR结合位点的片段,并利用试剂盒制作结合位点的突变型片段。然后利用荧光素酶基因报告手段进行验证。4.利用miRNA-124 mimic和miRNA-124 inhibitor验证miRNA-124对NSCLC增殖能力和迁移能力的影响首先利用lipofectin试剂盒将miRNA-124 mimic和miRNA-124 inhibitor转染人NSCLC细胞系A549和H1299,然后CCK-8检测两种试剂对两个细胞系肿瘤细胞增殖能力的影响,并利用Transwell检测方法检测2种细胞系接受处理后迁移能力的变化。结果1. NSCLC患者肿瘤组织中miRNA-124表达量降低在本部分的研究中,我们发现在9个配对的NSCLC样本中,有8组肿瘤组织的miRNA-124的表达量显著低于临近的正常肺支气管组织(8/9,88.9%)2.SOX8是miRNA-124的靶点基因在荧光素酶基因报告检测中,我们发现与突变型SOX83’UTR片段相比较,miRNA-124使野生型SOX83’UTR片段的相对荧光活性降低(P=0.002)。在NSCLC细胞系H1299中,通过Western blot检测,我们发现miRNA-124 mimics降低了SOX8蛋白质的表达,而miRNA-124抑制物则使SOX8蛋白的表达升高,这一结果进一步证实了miRNA-124对SOX8基因的调控作用。3. miRNA-124高表达抑制NSCLC细胞系的细胞增殖能力在本部分试验中我们分别用miRNA-124 mimic(模拟miRNA-124高表达)和miRNA-124 inhibitor分别转染人NSCLC田胞系A549和H1299,细胞增殖实验显不,miRNA-124 mimic降低了两种细胞系的增殖能力,而miRNA-124 inhibitor则起到了相反的作用,增强了两种细胞系的增殖能力(P<0.05)。4. miRNA-124高表达抑制NSCLC细胞系的细胞迁移能力在上一步部分试验中我们发现SOX8的过度表达与NSCLC患者淋巴结转移之间存在相关关系,因此在本部分试验中我们分别用miRNA-124 mimic(模拟miRNA-124高表达)和miRNA-124 inhibitor分别转染人NSCLC细胞系A549和H1299,并利用Transwell实验研究了miRNA-124对细胞系迁移能力影响。结果显示,miRNA-124 mimic显著抑制了A549细胞和H1299细胞的迁移能力(P<0.05),而miRNA-124 inhibitor则增强了两种NSCLC细胞系的迁移能力,结果显示miRNA-124的高表达可以有效降低NSCLC细胞系的迁移能力。结论1. miRNA-124在NSCLC中的表达低于正常肺组织2. miRNA-124是SOX8基因的转录调控因子,miRNA-124的过表达可以在转录后和翻译水平上降低SOX8基因的表达。3. miRNA-124过表达可以有效降低人NSCLC细胞系A549和H1299的增殖能力和迁移能力。第三部分miRNA agomir-124治疗非小细胞型肺癌裸小鼠皮下种植瘤模型的研究目的由于体外状况的实验条件与正常机体内部的生理环境差别巨大,因此为更贴近客观生理状态下miRNA-124的可能的治疗作用,我们在本部分中决定对裸鼠NSCLC细胞系A549皮下种植瘤模型利用miRNA agomir-124进行体内实验研究。方法利用人NSCLC细胞系A549建立裸小鼠皮下种植瘤,在建模8天后进行miRNA agomir-124进行处理(1 nmol/50μL,每隔4天1次)。每隔4天测量肿瘤体积变化,并在建模后第36天处死小鼠,取瘤并称重。结果1. miRNA agomir-124对人NSCLC细胞系A549皮下种植瘤生长的影响与对照组(空白对照组)相比,实验组(miRNA agomir-124治疗组)自肿瘤后16天起的皮下种植瘤体积增加速度减慢(P<0.01),同时实验终止时所取瘤体治疗显著减小(411.8 mg vs.227.1 mg, P<0.01),抑瘤率为38.5%。结论1.人NSCLC细胞系A549裸小鼠皮下种植瘤建模成功。2. miRNA agomir-124可以作为动物实验中研究miRNA-124功能的理想工具。3.模拟miRNA-124高表达的miRNA agomir-124可以有效抑制NSCLC皮下种植瘤的生长,与细胞水平研究结果一致,证实miRNA-124是抑制NSCLC肿瘤生长的抑癌因子。利用miRNA-124治疗NSCLC肿瘤是一种可能的治疗手段。