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目的:肺癌发病率与死亡率增长较为迅速,成为对人类健康与生命威胁最大的恶性肿瘤之一。非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC)发生率约占肺癌发生率的80%,其发生机制始终是生命科学研究的焦点。在对肺癌多药耐药性研究过程中,科研工作者发现了穹窿主体蛋白(major vault protein,MVP),它是穹窿蛋白复合物的主要成分。已有研究认为MVP和穹窿蛋白复合体的表达水平,随着多种类型肿瘤恶性发展的而随之上调,说明MVP与肿瘤的发生发展密切相关。因此本课题拟研究穹窿主体蛋白在非小细胞肺癌生长中的作用及机制,为进一步探索肺癌诊断和预后标记物,以及为研究治疗靶点提供崭新的思路方法和技术手段。方法:1.本研究首先分别构建shRNA-MVP/cDNA过表达慢病毒载体,运用病毒稳定转染技术将病毒载体导入路易斯肺癌细胞株,并用嘌呤霉素筛选稳定低表和过表达MVP的路易斯肺癌细胞。2.运用Western blot方法分别验证MVP干扰效率和过表达效率。3.离体细胞实验:(1)通过CCK8实验,平板克隆实验,EDU掺入实验和流式细胞术检测MVP表达水平对路易斯肺癌细胞增殖的影响。(2)用10%胎牛血清恢复培养不同时间点,检测下调MVP基因表达后,细胞内ERK通路是否被激活。(3)构建MVP质粒,运用瞬时转染的方法,使MVP在shRNA-MVP细胞内进行外源性表达,由此观察当外源性恢复MVP表达水平后,相应被激活的ERK信号通路是否继而发生逆转性下调。4.在体动物实验:(1)构造在体皮下植瘤模型,将培养的稳定低表达MVP的路易斯肺癌细胞与对照组细胞注入C57BL/6J小鼠皮下组织,约三周后剥取肿瘤,统一标准测量瘤体体积和重量,并进行统计学分析比较。(2)使用免疫组织化学技术检测瘤体中与增殖指标Ki67和血管新生指标CD31的表达情况。(3)Western blot方法检测瘤体中ERK信号通路激活情况。结果:1.运用慢病毒稳定转染系统成功构建稳定低表达/过表达MVP的路易斯肺癌细胞,并经由Western blot方法鉴定,相比较于对照组(shRNA-N),shRNA-MVP1和shRNA-MVP2细胞中MVP蛋白表达水平明显下调;而与对照组(LV5-NC细胞)相比,LV5-MVP细胞中MVP蛋白表达水平显著上调,说明细胞株构建成功。2.离体实验发现:下调MVP基因表达能够提高路易斯肺癌细胞的增殖能力,同时影响细胞周期分布;相反当MVP蛋白过表达时能显著抑制路易斯肺癌细胞的增殖能力。3.相应机制研究发现:下调MVP基因表达能够激活路易斯肺癌细胞内ERK信号通路,而不激活AKT信号通路。而当shRNA-MVP细胞株外源性恢复MVP表达时,起初被激活的ERK信号通路就会发生逆转性下调。4.在体皮下植瘤模型发现:与对照组细胞形成的肿瘤相比,稳定低表达MVP路易斯肺癌细胞所形成的肿瘤瘤体的重量和体积均明显增加,并且瘤体中与增殖指标Ki67和血管新生指标CD31的免疫组化染色阳性区域显著较多,ERK信号通路也处于激活状态。结论:MVP可以抑制离体状态路易斯肺癌细胞的增殖,同时影响其细胞周期的分布。MVP这种抑制作用主要是通过阻滞ERK信号通路来实现。在体皮下植瘤模型证实MVP可抑制路易斯肺癌细胞所形成肿瘤的生长及血管新生。