基于RNA-seq对大白菜Ogura型细胞质雄性不育机制的研究

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从野生萝卜中发现的Ogura型细胞质雄性不育(Ogura CMS)系具有花粉完全败育的特征,这一特性在杂种优势利用中起着至关重要的作用。该不育系由线粒体基因orf138位点所控制,其通过联合atp8基因共转录产生ORF138蛋白质,从而引发了雄性不育基因的表达,最终导致花粉完全败育。Ogura CMS基因在其它作物中的形态学表现相继被鉴定出来,但在大白菜(Brassica rapa ssp.Pekinesis)中的研究还十分有限,且orf138基因所引发的细胞核中产生的分子机制变化目前还不清楚。因此,为了深入探究Ogura CMS在大白菜中的表现特征和响应机制,本研究以Ogura CMS大白菜及其同型保持系为实验材料,首先分别从形态学、细胞学两个方面观察其败育特征并确定败育时期,其次分别对花粉发育早期(四分体时期至双核期:花粉败育过程)和晚期(三核期:败育结果)进行取材测序并对其差异表达基因进行分析,以探究基因层面的败育原因。主要结果如下:1.通过对Ogura CMS系大白菜和保持系的花器官进行形态观察,结果显示该不育系雄蕊的花丝比保持系更短,且开花期的花药并没有像保持系一样散出饱满的花粉粒,而是呈透明、干瘪的状态。通过进一步的扫描电子显微镜观察,结果显示保持系花药内部腔室充盈着饱满、丰富的花粉粒,而不育系花药中内部呈空腔状态,且开花期花药整体萎蔫、皱缩,无花粉粒散出,表现出典型的花粉完全败育特征。2.为确定该不育系的败育时期,对Ogura CMS系大白菜及其保持系进行细胞学观察。花粉细胞减数分裂PI染色观察结果显示,该不育系的染色体行为正常。而从小孢子发育观察结果显示,该不育系在单核靠边期开始发生核降解,至三核期其细胞核物质几乎完全消失,并没有形成典型的两个精核、一个营养核的成熟花粉粒特征。对花药进行石蜡切片观察,结果显示该不育系绒毡层细胞在四分体时期开始出现异常,表现出异常膨大和空泡化现象。与此同时,通过对花粉壁结构进行超微结构观察,发现该不育系花粉壁小柱、内壁等结构的发育存在缺陷。3.对两种株系的花粉发育早期(败育过程)和晚期(败育结果)分别进行转录组测序,分析结果表明,在花粉发育早期,不育系中细胞色素C和细胞程序性死亡(PCD)相关基因上调表达,而调控花粉壁发育以及有丝分裂活动的基因下调表达,如苯丙烷合成通路关键酶(4CL1、4CL5、CAD2、CAD5)、细胞周期调控(CYCA2、RSW7、ATK5等)等相关基因。在花粉发育晚期,不育系中抵御过氧化物损伤的基因如谷胱甘肽氧化还原反应基因(GPX6、GPX7、G6PD2和PGD1)、细胞自噬信号通路基因(ATG1、ATG2、ATG5、ATG6、VPS15、VPS34等)显著上调。根据以上研究结果,可以初步得到orf138线粒体基因突变后细胞核基因的分子响应机制。Ogura CMS大白菜中线粒体基因orf138突变后,激发绒毡层细胞的程序性死亡机制导致其内容物异常降解,进一步影响小孢子有丝分裂进程和花粉壁的发育。而花粉壁的缺陷使花粉受到外界刺激和损伤,进而小孢子发生自噬。综合以上各种因素最终导致了Ogura CMS大白菜无法产生具有活力的可育花粉,进而表现出完全败育的雄性不育特征。
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