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目的:胶质母细胞瘤(Glioblastoma,GBM)是神经上皮源性肿瘤,按照WHO病理分级,GBM是恶性程度最高,侵袭性最强的恶性脑胶质瘤。尽管给予积极的手术治疗,并辅助术后放疗和化疗,GBM患者的5年生存率仍小于5%,预后很差。GBM对化疗的耐药性和放疗的抵抗性是影响疗效的重要因素。目前,研究者们从基因组学、遗传学和表观遗传学等多角度研究胶质母细胞瘤的发病机制,针对胶质母细胞瘤发病机制的研究已成为诊断和靶向治疗的关键。非编码RNAs(non-coding RNAs,ncRNAs)人类基因组中的多数基因的转录产物之一。一般分为短链非编码RNAs和长链非编码RNAs(long non-coding RNAs,lncRNAs)。其中,短链非编码RNAs主要包括microRNAs(miRNAs)、short-interfering RNAs(siRNAs)和PIWI-interacting RNAs(piRNAs)。piRNAs一般通过与Argonaute蛋白家族的亚家族,即PIWIL蛋白亚家族结合,发挥基因沉默及调控和维持种系DNA稳定的功能。LncRNAs的生物学功能主要表现在转录或者转录后水平调控基因的表达。miRNAs在基因表达调控和调节细胞功能中起重要作用。RNA结合蛋白(RBPs)是一类伴随RNA的调控代谢过程,与RNA结合的蛋白质的总称。RBPs的主要作用是介导RNA的成熟、转运、定位和翻译。RBPs普遍表达于各种肿瘤细胞中,RBPs参与对肿瘤细胞生物学行为的调控。以RBPs、多种ncRNA、转录因子和靶基因组成的以ncRNA为中心的分子调控网络参与调节多种肿瘤的发生发展。本研究第一部分首先明确PIWIL3、piR-30188、OIP5-AS1、miR-367-3p、CEBPA和TRAF4的内源性表达以及对GBM生物学行为的影响,进一步探讨上述因子之间可能的作用方式以及它们对GBM的生物学行为调节的分子机制;第二部分首先明确TDP43、SNHG12、miR-195和SOX5在胶质瘤组织和细胞中的表达,以及TDP43、SNHG12、miR-195、SOX5和Gelsolin之间的调控关系和对胶质瘤细胞生物学行为的调控作用。本研究旨在揭示胶质瘤发生发展的新的分子机制,并为GBM的治疗提供新策略。研究方法:培养人源的GBM细胞系—U87、U251细胞,正常人源星型胶质细胞,和人源胚肾细胞HEK293。胶质瘤组织样本来源于中国医科大学附属盛京医院神经外科。应用Real-time PCR和原位杂交检测piR-30188、miR-367-3p、OIP5-AS1以及SNHG12和miR-195的表达。应用Western blot方法检测PIWIL3、TRAF4、CEBPA以及TDP43、SOX5和Gelsolin在人正常脑组织、脑胶质瘤组织、人正常星型胶质细胞、人脑胶质瘤细胞的表达水平。应用CCK-8法检测细胞增殖能力。采用Transwell法检测细胞迁移和侵袭能力的变化。应用流式细胞仪检测细胞凋亡能力。通过细胞转染方法构建PIWIL3、piR-30188、OIP5-AS1、miR-367-3p、TRAF4、CEBPA、TDP43、SNHG12、miR-195和SOX5过表达和/或表达沉默的细胞系。Real-time PCR方法检测PIWIL3、piR-30188、OIP5-AS1、miR-367-3p、TRAF4、CEBPA以及TDP43、SNHG12、miR-195和SOX5的表达变化。放射菌素D作用下检测RNA半衰期的变化。采用RIP方法和RNA pull-down方法检测piR-30188和PIWIL3、SNHG12和TDP43的结合作用。双荧光素酶基因报告分析系统检测piR-30188和OIP5-AS1、OIP5-AS1和miR-367-3p、SNHG12和miR-195的结合作用与结合位点。应用免疫共沉淀法检测CEBPA与TRAF4、CEBPA与PIWIL3启动子的直接结合作用,以及SOX5与Gelsolin、SOX5与SNHG12启动子的直接结合作用。裸鼠移植瘤实验检测PIWIL3、OIP5-AS1、miR-367-3p,以及TDP43、SNHG12和miR-195对裸鼠移植瘤的生长和生存时间的影响。结果:1.PIWIL3和piR-30188在胶质瘤组织和细胞中低表达,过表达PIWIL3以及过表达piR-30188分别显著抑制U87和U251胶质瘤细胞的增殖,迁移和侵袭能力,促进细胞凋亡。2.OIP5-AS1在胶质瘤组织和细胞中高表达,沉默OIP5-AS1的表达显著抑制胶质瘤细胞的增殖,迁移和侵袭能力,促进细胞凋亡。3.与单独应用过表达PIWIL3、过表达piR-30188和沉默OIP5-AS1的表达组相比,三者联合应用组显著抑制胶质瘤细胞的增殖,迁移和侵袭能力,促进细胞凋亡。4.过表达PIWIL3以及过表达piR-30188分别显著抑制OIP5-AS1的表达,双过表达PIWIL3和piR-30188显著抑制OIP5-AS1的表达。5.PIWIL3与piR-30188存在靶向结合作用。6.OIP5-AS1与piR-30188存在靶向结合作用。7.miR-367-3p在胶质瘤组织和细胞中低表达,上调miR-367-3p的表达显著抑制胶质瘤细胞的增殖,迁移和侵袭能力,促进细胞凋亡;沉默miR-367-3p的表达显著增加胶质瘤细胞的增殖,迁移和侵袭能力,抑制细胞凋亡。8.过表达PIWIL3、过表达piR-30188和沉默OIP5-AS1的表达分别显著增加胶质瘤细胞的miR-367-3p的表达;与单独应用过表达PIWIL3、过表达piR-30188和沉默OIP5-AS1的表达组相比,三者联合应用显著增加miR-367-3p的表达。9.过表达miR-367-3p显著降低胶质瘤细胞中OIP5-AS1的表达;沉默miR-367-3p的表达显著增加OIP5-AS1的表达。10.OIP5-AS1与miR-367-3p存在靶向结合作用,并存在于RISC复合体中。11.过表达PIWIL3、过表达piR-30188和沉默OIP5-AS1的表达分别显著抑制胶质瘤细胞CEBPA和TRAF4的蛋白表达;与单独应用过表达PIWIL3、过表达piR-30188和沉默OIP5-AS1的表达组相比,三者联合应用显著抑制CEBPA和TRAF4的蛋白表达。12.过表达miR-367-3p显著降低胶质瘤细胞的CEBPA的mRNA和蛋白的表达,沉默miR-367-3p的表达显著增加CEBPA的mRNA和蛋白的表达。13.过表达miR-367-3p显著降低胶质瘤细胞的TRAF4的蛋白表达,沉默miR-367-3p的表达显著增加TRAF4的蛋白表达。14.miR-367-3p与CEBPA的3,UTR区存在靶向结合作用,miR-367-3p通过作用于CEBPA的3,UTR调节胶质瘤细胞的增殖,凋亡,迁移和侵袭能力。15.CEBPA在人脑胶质瘤组织和细胞中高表达,沉默CEBPA的表达显著抑制胶质瘤细胞的增殖,迁移和侵袭能力,促进细胞凋亡。16.沉默OIP5-AS1的表达联合过表达miR-367-3p显著降低胶质瘤细胞的CEBPA的表达,降低细胞的增殖,迁移和侵袭能力,促进细胞凋亡;而双沉默OIP5-AS1和miR-367-3p的表达,未明显改变胶质瘤细胞中CEBPA的表达,未对胶质瘤细胞的增殖,凋亡,迁移和侵袭能力产生有统计学意义的作用。17.TRAF4在人脑胶质瘤组织和细胞中高表达,沉默TRAF4的表达显著抑制胶质瘤细胞的增殖,迁移和侵袭能力,促进细胞凋亡。18.沉默CEBPA的表达显著降低胶质瘤细胞中TRAF4的mRNA和蛋白表达。19.CEBPA与TRAF4的启动子直接结合。20.沉默CEBPA显著降低PIWIL3的mRNA和蛋白表达,CEBPA与PIWIL3的启动子直接结合。21.单独过表达PIWIL3、沉默OIP5-AS1以及过表达miR-367-3p,均显著抑制了U87和U251裸鼠移植瘤的生长,并延长了裸鼠的生存期。与单独过表达PIWIL3、沉默OIP5-AS1以及过表达miR-367-3p组相比,三者联合应用组显著抑制了裸鼠移植瘤的生长,并显著延长了裸鼠的生存期。22.TDP43和SNHG12在胶质瘤组织和细胞高表达,SNHG12存在于胶质瘤细胞的细胞核和细胞浆中。沉默TDP43的表达,以及沉默SNHG12的表达分别显著抑制U87和U251胶质瘤细胞的增殖,迁移和侵袭能力,促进细胞凋亡。与单独沉默TDP43或SNHG12的表达组相比,双沉默TDP43和SNHG12的表达显著抑制胶质瘤细胞的增殖,迁移和侵袭能力,促进细胞凋亡。23.TDP43与SNHG12存在靶向结合作用。24.沉默TDP43的表达显著减少了SNHG12的半衰期。25.miR-195在胶质瘤细胞中低表达,miR-195存在于胶质瘤细胞的细胞核和细胞浆中。过表达miR-195显著抑制胶质瘤细胞的增殖,迁移和侵袭能力,促进细胞凋亡;而沉默miR-195的表达显著增加胶质瘤细胞的增殖,迁移和侵袭能力,抑制细胞凋亡。26.沉默TDP43的表达,以及沉默SNHG12的表达显著增加胶质瘤细胞中miR-195的表达,与单独沉默TDP43的表达或沉默SNHG12的表达组相比,双沉默TDP43和SNHG12的表达显著增加胶质瘤细胞中miR-195的表达。27.过表达miR-195显著抑制胶质瘤细胞中SNHG12的表达,沉默miR-195的表达显著增加SNHG12的表达。28.SNHG12与miR-195存在靶向结合作用,二者结合于RISC复合体中。29.沉默SNHG12的表达联合过表达miR-195显著抑制胶质瘤细胞的增殖,迁移和侵袭能力,促进细胞凋亡;而双沉默SNHG12与miR-195未对胶质瘤细胞的增殖,凋亡,迁移和侵袭产生有统计学意义的作用。30.SOX5在胶质瘤组织和细胞中高表达,沉默SOX5的表达显著抑制胶质瘤细胞的增殖,迁移和侵袭能力,促进细胞凋亡。31.单独沉默TDP43或SNHG12的表达显著降低SOX5的蛋白表达;与单独沉默TDP43或SNHG12的表达组相比,双沉默TDP43和SNHG12的表达显著降低SOX5的蛋白表达。32.过表达miR-195显著降低SOX5的蛋白表达;沉默miR-195的表达显著增加SOX5的蛋白表达。沉默SNHG12的表达联合过表达miR-195显著降低SOX5的蛋白表达;而双沉默SNHG12和miR-195则未对SOX5的蛋白表达产生有统计学意义的作用。33.miR-195与SOX5的3,UTR区存在靶向结合作用。miR-195通过结合SOX5的3,UTR区调节胶质瘤细胞的增殖,凋亡,迁移和侵袭能力。34.沉默SNHG12的表达、过表达miR-195分别显著降低胶质瘤细胞中Gelsolin的蛋白表达,沉默miR-195显著增加Gelsolin的蛋白表达;沉默SNHG12的表达联合过表达miR-195显著降低胶质瘤细胞中Gelsolin的蛋白表达,而双沉默SNHG12和miR-195的表达未明显改变胶质瘤细胞中Gelsolin的蛋白表达。35.沉默SOX5的表达显著降低胶质瘤细胞中Gelsolin的蛋白表达;沉默miR-195的表达显著增加胶质瘤细胞中Gelsolin的蛋白表达,双沉默miR-195和SOX5的表达未明显改变胶质瘤细胞中Gelsolin的蛋白表达。36.SOX分别与Gelsolin的启动子区和SNHG12的启动子区结合。37.过表达SOX5显著增加SNHG12的表达,而沉默SOX5的表达则显著降低SNHG12的表达。38.单独沉默TDP43的表达,沉默SNHG12的表达,以及过表达miR-195,均显著抑制了U87和U251裸鼠移植瘤的生长,并延长裸鼠的生存期。与单独沉默TDP43的表达,沉默SNHG12的表达,以及过表达miR-195组相比,三者联合应用组显著抑制了裸鼠移植瘤的生长,并显著延长了裸鼠的生存期。结论:1.piR-30188通过结合PIWIL3,发挥抑制胶质瘤细胞的恶性生物学行为的作用。piR-30188靶向结合OIP5-AS1,并负性调控其表达,调节胶质瘤细胞的生物学行为。2.OIP5-AS1靶向结合miR-367-3p,并负性调控其表达,发挥促进胶质瘤细胞的恶性生物学行为的作用。3.miR-367-3p靶向结合CEBPA的3,UTR区,发挥抑制胶质瘤细胞的恶性生物学行为的作用。4.CEBPA与TRAF4的启动子区结合,正性调控其转录,发挥促进胶质瘤细胞的恶性生物学行为的作用。5.CEBPA与PIWIL3的启动子区结合。6.PIWIL3/piR-30188/OIP5-AS1/miR-367-3p/CEBPA反馈环路在调节胶质瘤细胞生物学行为中发挥重要作用。7.TDP43靶向结合SNHG12,并增加其稳定性,上调其表达,发挥促进胶质瘤细胞的恶性生物学行为的作用。8.SNHG12靶向结合miR-195,并负性调控其表达,发挥促进胶质瘤细胞的恶性生物学行为的作用。9.miR-195靶向结合SOX5的3,UTR区,发挥抑制胶质瘤细胞的恶性生物学行为的作用。10.SOX5与Gelsolin的启动子区结合,正性调控其转录,发挥促进胶质瘤细胞的恶性生物学行为的作用。11.SOX5与SNHG12的启动子区结合,形成正反馈环路,调节胶质瘤细胞的生物学行为。12.TDP43/SNHG12/miR-195/SOX5反馈环路在调节胶质瘤细胞生物学行为中发挥重要作用。