研究背景骨关节炎(osteoarthritis,OA)是一种以关节软骨细胞减少、关节基质破坏为主要病理改变慢性骨关节疾病,是导致中老年人疼痛和残疾的最常见原因之一。流行病学调查显示中国40岁以上中老年人膝关节骨关节炎总患病率为17.0%,患病率随年龄增长而增加,65岁以上老龄人口患病率可达60-700%。由于老龄化人口的增加,骨关节炎已成为影响人类健康的世界性的问题。研究发现多种因素可导致关节软骨退变,包括年龄、肥胖、劳损、创伤和炎症等。骨关节炎的发病机制仍在不断完善中,越来越多的研究证明,免疫反应参与了骨关节炎的发病,包括细胞免疫、体液免疫异常、自身免疫相关信号通路激活等。关节软骨退变的机制需要更多的临床和实验研究进行探讨。非编码RNA(non-coding RNAs,ncRNAs)是指不能翻译成蛋白质的RNA。其中,长度大于200nt的被称为长链非编码RNA(long non-coding RNAs,lncRNAs)。近年来的大量研究表明,lncRNAs能够从表观遗传学、转录调控、转录后调控等多方面调控基因的表达水平。广泛参与了胚胎发育、细胞分化、新陈代谢以及疾病发生等重要的生命进程。lncRNAs通过与蛋白复合物或转录因子相互作用对免疫细胞的分化进行调节,并且通过调节炎症反应中炎症因子的表达,参与炎症反应调控,与风湿性疾病发生发展、免疫应答、免疫细胞分化以及免疫系统动态平衡密切相关。IncRNAs还参与调控软骨细胞增殖、分化、凋亡过程,影响软骨细胞外介质的分泌、降解,调节炎症因子释放,在骨关节炎的发病过程中发挥重要作用。转移相关肺腺癌转录体 1(Metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1,MALAT 1)是新近发现的一种IncRNA,被认为是一种对多种癌症预后具有提示作用的生物标志物。实验研究证明,MALAT 1通过同NF-κ B途径相互作用调节脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激的炎症反应。目前尚无MALAT1在骨性关节炎发病机制中作用的研究,因此,需要其进行更多的探讨。microRNAs(miRNAs)是另一种存在于真核细胞中的含有约22nt的非编码RNA。IncRNAs能够调控真核细胞miRNAs的表达。micro-19b(miR-19b)通过调节NF-K B通路参与多种炎症反应的调控。目前尚不清楚miR-19是否在骨关节炎中具有类似的抗炎作用,我们还需要更多的研究来探索miR-19b对骨关节炎的影响。因此,在本研究中我们使用LPS,建立小鼠软骨细胞株ATDC 5细胞炎性损伤模型。观察MALAT 1和miR-19b对LPS诱导ATDC 5细胞在活性抑制、凋亡诱导和促炎细胞因子表达等方面的潜在影响。此外,还分析了 MALAT1和miR-19b对LPS诱导的Wnt/β-catenin和NF-K B通路激活的影响。这一研究有助于进一步了解MALAT 1和miR-19b在骨关节炎发病机制中的作用,并为骨关节炎治疗提供可能的诊断及治疗靶点。研究目的本研究旨在探讨长链非编码RNA转移相关肺腺癌转录因子1(lncRNA MALAT 1)对脂多糖(LPS)诱导的小鼠软骨祖细胞(ATDC5)炎症损伤的影响,并探讨其可能机制。研究方法1、LPS诱导ATDC5细胞凋亡和炎性损伤。在DMEM/F12中培养ADTC5细胞,应用LPS进行处理。采用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)法测定不同浓度LPS处理后的ATDC5细胞活性。采用AnnexinV-PE染色法检测不同浓度LPS处理后的ATDC5细胞凋亡。应用Western blotting方法检测不同浓度LPS处理后凋亡相关蛋白Bcl-2、BaxPro-caspase3、Cleaved-caspase3、Pro-caspase9 和 Cleaved-caspase9 的表达。分别用定量逆转录PCR(qRT-PCR)和Western blotting方法检测LPS处理后ATDC5细胞中IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α的mRNA和蛋白表达。应用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测LPS处理后ATDC5细胞培养上清中IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α的浓度。2、LPS处理后ATDC 5细胞中MALAT1的表达。用定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)检测LPS处理后ATDC5细胞中MALAT1的表达。3、MALAT1对LPS诱导的ATDC 5细胞炎性损伤的作用。用pEX-MALAT1和shMALAT1转染LPS处理后的ATDC5细胞。分别用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)法和 AnnexV-pe 染色法检测 LPS 处理 pEX-MALAT1 和 sh-MALAT1转染后ATDC5细胞活性和凋亡率。用qRT-PCR检测ATDC 5细胞中MALAT1的表达。设立对照组、LPS处理组、LPS+pEX组、LPS+pEX+MALAT1组和LPS+shNC组、LPS+sh+MALAT1 组。Western blotting 方法分别检测各组 Bcl-2、Bax、Pro-caspase 3、.Cleaved-caspase 3、Cleaved-caspase 9、Pro-caspase 9 的表达,用 qRT-PCR 和 Western blotting 检测各组 ATDC5 细胞中 IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α的mRNA和蛋白表达。ELISA法检测上清液中的IL-1β,IL-6、IL-8和TNF-α的浓度。4、MALAT1对ATDC5细胞中miR-19b表达的调控。转染pEX-MALAT1或sh-MALAT1后,用qRT-PCR方法检测转染后ATDC5细胞中miR-19b的表达。5、MALAT1通过miR-19b调控LPS诱导ATDC5细胞的炎症损伤。用miR-19b抑制剂转染ATDC5细胞。采用qRT-PCR法检测转染miR-19b抑制剂后ATDC5细胞中miR-19b的表达。分别用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)、Annexinv-pe染色和Western印迹法检测ATDC5细胞活性、细胞凋亡及Bcl-2、Bax、Pro-caspase 3、Cleaved-caspase 3、Cleaved-caspase 9、Pro-caspase 9的表达。分别采用定量逆转录PCR(qRT-PCR)、Western blotting和酶联免疫吸附试验(ELISA)进行检测ATDC5细胞中IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-A mRNA和蛋白的表达,以及ATDC5细胞培养上清中IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α的浓度。6、MALAT1与ATDC5细胞中Wnt/β-catenin和NF-κ B信号通路相关性。应用Western blotting分析转染miR-19b抑制剂后对照组、LPS组、LPS+pEX+NC 组、LPS+pEX-MALAT1+NC 组和 LPS+pEX-MALAT1+miR-19b抑制剂组ATDC 5 细胞中 Wnt 3α、β-catenin、t-Iκ Bα、p-Iκ B、t-p65 和 p-p65 的表达。研究结果1、LPS诱导ATDC5细胞凋亡和炎性损伤LPS能够明显抑制ATDC 5细胞活性,且具有剂量依赖性。2.5μ g/ml或5μg/ml LPS处理后,细胞凋亡率均升高,5μ g/ml LPS处理后的凋亡率明显高于2.5μ g/ml LPS。LPS 能够上调 ATDC 5 细胞 Bax、Pro-caspase 3、Cleaved-caspase 3、Cleaved-caspase 9、Pro-caspase 9,下调 Bcl-2 的表达,且 5μg/ml 作用强于 2.5μg/ml。LPS 能够显著增加 IL-1p、IL-6、IL-8 和 TNF-α 的 mRNA 表达。2、LPS刺激ATDC5细胞中MALAT 1的表达上调。经2.5μg/ml及5μg/ml LPS处理后,ATDC5细胞中MALAT1的表达上调。3、MALAT1对LPS诱导的ATDC 5细胞炎性损伤的保护作用转染pEX-MALAT1可显著增加ATDC5细胞中MALAT1的表达,而sh-MALAT1则显著降低了 MALAT1的表达。转染pEX-MALAT 1能显著抑制LPS处理ATDC 5细胞出现的活性抑制和凋亡增加,而sh-MALAT 1转染则出现与之相反效应。转染 pEX-MALAT 1 还能够抑制 LPS 诱导的 Bax、Cleaved-caspase 3 和Cleaved-caspase 9的表达增加以及Bcl-2的表达下降,而sh-MALAT1转染则使bcl-2的表达下降。此外,pEX-MALAT 1转染后降低了 LPS诱导的ATDC5细胞上清液中的IL-1β,IL-6、IL-8和TNF-α的浓度,而转染sh-MALAT 1则使其浓度升高。4、MALAT1对ATDC5细胞miR-19b表达呈正向调控作用。转染pEX-MALAT1显著上调了 ATDC5细胞中miR-19b的表达。而sh-MALAT1转染明显下调了 ATDC5细胞miR-19b的表达。5、MALAT1通过上调miR-19b减轻LPS诱导的ATDC 5细胞炎症损伤。转染miR-19b抑制剂后,ATDC5细胞中miR-19b的表达明显降低。转染miR-19b抑制剂后,MALAT1对LPS诱导的ATDC5细胞活性抑制和凋亡诱导的保护作用显著下降。与LPS+pEX-MALAT1组相比,LPS+pEX-MALAT1+miR-19b抑制剂组Bax、Cleaved-caspase 3 和 Cleaved-caspase 9 的表达增加,Bcl-2 表达降低。此外,miR-19b抑制剂转染可逆转pEX-MALAT1对LPS诱导的ATDC5细胞促炎细胞因子表达的影响。6、MALAT 1 通过上调 miR-19b 抑制 LPS 诱导的 ATDC 5 细胞 Wnt/β-catenin和NF-κ B通路的激活。LPS 通过上调 ATDC5 细胞 Wnt3α、β-catenin、p-IK Bα 和 p-p65 的表达显著激活ATDC5细胞Wnt/β-catenin和NF-κ B通路。pEX-MALAT1转染可通过下调LPS诱导的Wnt3α、β-catenin、p-IK Bα和p-p65的表达,从而显著逆转LPS诱导的ATDC 5细胞Wnt/β-catenin和NF-κ B通路的激活。miR-19b抑制剂转染能明显逆转pEX-MALAT1对LPS诱导的Wnt/β-catenin和NF-κ B通路的激活作用。结论LPS显著诱导ATDC5细胞凋亡及炎症损伤。在LPS处理的ATDC5细胞中MALAT1表达升高。MALAT1过度表达显著抑制LPS诱导的ATDC5细胞炎症损伤,抑制MALAT1得到相反的效果。进一步研究结果表明,MALAT1对ATDC5细胞表达miR-19b具有正向调节作用。下调miR-19b明显逆转MALAT1对LPS处理的ATDC5细胞的保护作用。此外,MALAT 1通过上调miR-19b抑制LPS诱导的ATDC5细胞WNT/β-catenin 和 NF-κ B 通路的激活。实验结果表明,miR-19b在MALAT1对LPS诱导的ATDC 5细胞炎症损伤的保护作用中起关键作用,MALAT 1通过上调miR-19b的表达减轻LPS诱导的ATDC 5细胞炎症损伤。