电离辐射联合低温等离子体影响肿瘤细胞G2/M期周期阻滞蛋白的机制初探

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目的:低温等离子体(Non-Thermal Plasma,NTP)是一种处于第四形态的混合气体,它包括了离子、电子、中子和自由基等多种形态。我们课题组前期大量实验已经证实:无论体内体外环境,低温等离子体都具有显著的杀灭肿瘤细胞的作用,而对正常细胞的杀伤作用较小。且已经明确在多种肿瘤细胞中小剂量的低温等离子体即具有明显的放射增敏效应。然而,关于低温等离子体对癌细胞的辐射增敏作用机制尚不清楚,有待进一步的研究。故本论文拟对电离辐射联合低温等离子体影响肿瘤细胞G2/M期周期阻滞蛋白的机制进行初步探索。方法:1、低温等离子体装置及X射线辐照仪参数设置参考课题组前期实验结果,实验中将癌细胞分成四组进行实验:空白对照组(Cont.)、单独低温等离子体照射组(NTP)、单独X射线照射组(IR)、低温等离子体联合X射线照射组(NTP+IR)。2、应用细胞免疫荧光染色技术,检测低温等离子体联合X射线对Hep-G2、HeLa细胞内γ-H2AX表达的影响。3、应用流式细胞术技术,检测联合照射后Hep-G2、HeLa细胞的细胞周期分布情况。4、应用Western Blot技术,检测联合照射后Hep-G2、HeLa细胞内相关周期阻滞蛋白的变化情况。5、应用质粒扩增和细胞瞬时转染技术,构建成功的ATR Ri的Hep-G2细胞模型;再应用Western Blot技术,检测联合照射后ATR Ri的Hep-G2细胞周期分布情况。结果:1、Hep-G2、HeLa细胞均在6h时γ-H2AX的表达达到高峰;且在12h和24h时,相较于单独电离辐射组,联合照射组γ-H2AX的表达显著增多。2、Hep-G2、HeLa细胞在单独等离子体照射组内G2/M期周期阻滞效应较小;在单独电离辐射组内出现一个G2/M期周期阻滞现象;在联合照射组内G2/M期周期阻滞现象更为显著。3、人为沉默Hep-G2细胞内的ATR基因后,低温等离子体对G2/M期的细胞周期阻滞效应随之消失,而电离辐射造成的G2/M期周期阻滞效应不受影响。结论:1、联合照射后更多的癌细胞DNA受到损伤,且损伤作用时间延长。2、联合照射后能产生更多的G2/M期周期阻滞效应,同时该靶点受Cdk1-Cyclin B1复合体的调控。3、低温等离子体是通过激活癌细胞ATR基因来调控后续的G2/M期周期阻滞效应。
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