自噬抑制对EPCs在静脉血栓机化再通中的作用及影响

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目的:体外诱导分化的内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs),应用大自噬抑制剂3-MA(3-甲基腺嘌呤)干预后移植到大鼠深静脉血栓模型体内,探讨干预后的EPCs在血栓机化再通中的作用,为深静脉血栓的治疗提供一种新的思路和实验依据。方法:1. Ficoll密度梯度离心法获取SD大鼠的骨髓单个核细胞(bonemarrow-derived mononuclear cells,BMMNCs),内皮祖细胞培养基(EGM-2MV)体外诱导分化为EPCs并进行鉴定。观察细胞形态学、内皮细胞系列标志VEGFR-2、vwF免疫组化,祖细胞标志CD133、CD34免疫荧光技术动态鉴定。MTT比色法观察其增值能力。2.血栓模型建立:采用缩窄肾下段下腔静脉结合三氯化铁浸润破坏血管内膜方法建立大鼠深静脉血栓模型,并饲养至10d。动物随机分四组,经大鼠股静脉穿刺注射1ml移植液体。A组(n=10):空白对照组,注射生理盐水;B组(n=10)EPCs移植组,移植含有10~6个EPCs的细胞悬液;C组(n=10):注射1ml3-MA稀释液(5mmol/l);D组(n=10):移植1ml经3-MA稀释液(5mmol/l)处理后的EPCs的细胞悬液。3.移植后分四个时间段(0天、7天、14天、28天)取出血栓段下腔静脉及血栓,应用免疫组织化学法、HE染色及电镜检测各组血栓中新生血管及机化再通的情况。4.采用SPSSl7.0软件进行分析。结果:1.新分离的骨髓单个核细胞(BMMNCs)呈圆形,大小不一,第3天左右细胞开始出现贴壁,形态呈梭形、卵圆形、纺锤形、三角形或不规则形,一周左右可见细胞集落、细胞呈线状排列,第10天左右细胞呈典型鹅卵石样外观。细胞生长曲线呈“S”形,EPCs在培养的7~13天时增殖较快,14天后进入平台期,生长曲线呈典型“s’’形外观。贴壁细胞的CD34、VEGF、vWF、CD133均表达阳性。2.体外成功诱导培养了大鼠骨髓源性EPCs;vWF免疫组化显示干预组(D组)的血栓再通毛细血管密度明显高于A、B、C三组;单纯EPCs移植组(B组)血栓内毛细血管密度高于A、C组;A、C组之间差异无统计学意义;扫描电镜显示血栓内可见管腔样结构,其中以D组密度最高。结论:适量抑制EPCs自噬,促进其增殖,移植后使血栓内血管的新生能力明显增强,加快血栓的机化和再通。
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