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研究背景和目的百草枯(paraquat,PQ)是一种接触性、高效除草剂,因其造价低廉、遇土即失活等优良特性,在农业工作中有广泛的应用。百草枯毒性极强,中毒后常可引起多脏器功能损伤(multiple organ dysfunction),死亡率可高达80%。目前对于百草枯中毒并没有特效的解毒药,对于百草枯中毒的治疗包括:单纯的支持治疗、抗氧化治疗、血液灌流、血液透析、免疫调节、肺移植等多种方式的组合,然而百草枯中毒的死亡率仍然没有明显的下降。尽管我国已经禁止了百草枯水剂的销售,但百草枯中毒事件仍时有发生。寻找能够效治疗百草枯的新方法、探索百草枯中毒的内在机制仍是当前急需解决的主要问题。临床工作中我们发现,百草枯中毒患者在基本情况差别不大的情况下,其预后存在明显的差异。基于以上发现,我们推测不同患者之间可能存在基因表达的差异,进而导致了百草枯中毒患者不同的结局。既往有研究分析了百草枯中毒细胞和动物模型的基因表达,结果表明百草枯引起的器官损害、死亡等可能与易感基因相关。Tomita M等人发现与百草枯中毒大鼠早期肺损伤相关的基因呈两倍升高,Goldman SM的研究结果提示百草枯导致的帕金森氏病存在易感基因。基于此,我们推测可能存在相关的易感基因或保护性基因导致百草枯中毒患者结局的不同。但目前还没有关于不同结局百草枯中毒患者基因表达差异的研究,之前的研究仅对比了正常组和百草枯中毒组间的基因表达差异。为了从基因水平探索百草枯中毒的机制,我们通过转录组测序分析百草枯中毒患者存活组与死亡组基因表达的差异,探索百草枯中毒治疗的新靶点,以期提高百草枯中毒的存活率。方法1.收集我院2015年12月至2018年12月百草枯中毒患者血液标本,同时收集患者的临床资料,包括年龄、性别、服毒量、服毒时间、既往病史、个人史、患者尿百草枯浓度、住院时间、结局等。2.提取患者全血RNA,送于北京博奥晶典生物技术有限公司进行Affymetrix表达谱芯片分析。对比存活组和死亡组测序结果,找出差异性表达基因。并通过 GO(Gene Ontology)功能富集分析和 KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)通路富集分析,进一步分析差异表达基因所涉及的生物学过程和相关的通路。3.应用荧光定量PCR(q-PCR)技术检测百草枯中毒患者全血中TSG-6的mRNA的表达水平,分析不同结局患者间TSG-6转录水平的表达差异。4.应用酶联免疫吸附(ELISA)的方法检测百草枯中毒患者血清中TSG-6蛋白的表达水平,对比分析存活组和死亡组间TSG-6蛋白表达的差异。结果1.共搜集到百草枯中毒患者血液标本21例,其中男性患者1 1例,女性10例;死亡患者9例,存活患者12例。对比分析存活组和死亡组的临床资料发现,死亡组服毒量明显高于存活组,死亡组住院时间比存活组较短,死亡组的APACHE2评分比存活组的高,死亡组动脉氧分压(PaO2)比存活组低,死亡组的白细胞计数(WBC)明显高于存活组,且两组间差异有统计学意义。2.我们共发现了 27901个差异基因,其中27732个基因是已知的蛋白质编码基因,169个基因序列是未在任何数据库中提及的新的差异基因。与存活组相比,240个差异基因具有显著的统计学意义,与存活组相比,死亡组中有154个基因下调和86个基因上调。在86个上调的差异性基因中,33个基因参与调节信号通路;在154个下调的差异性基因中,36个基因参与调节信号通路。3.差异基因的GO分析结果显示,这些基因涉及了 25个生物过程,17个细胞组分,12个分子功能。其中5个与百草枯中毒结局有显著联系的、低误判率的、靶向性的基因功能分类分别是免疫球蛋白受体结合,趋化因子受体活性,免疫球蛋白复合物,网格蛋白包被的内吞作用,血液微粒。4.KEGG分析结果显示,与百草枯中毒结局关系最为显著的通路包括:细胞因子-细胞因子受体相互作用通路,趋化因子信号通路,PI3K-AKT信号通路,代谢、DNA损伤和基因修复,细胞免疫等信号通路。5.百草枯中毒患者不同结局、不同剂量分组间的差异基因分析结果显示,TSG-6在高剂量存活组(A2)表达量明显高于低剂量存活组(C2),而且在炎症因子中表达量改变最为显著;相对于高剂量死亡组(C1),低剂量死亡组(A1)组TSG-6明显降低3倍。6.全血TSG-6的mRNA表达水平检测结果显示,TSG-6在高剂量存活组(A2)表达量明显高于低剂量存活组(C2),而且在炎症因子中表达量改变较为显著(1.47倍),与转录组测序结果一致;相对于高剂量死亡组(C1),低剂量死亡组(A1)TSG-6明显升高5.71倍,该结果与转录组测序结果相反。存活组TSG-6的表达量要低于死亡组,两组间的差异具有统计学意义。TSG-6的mRNA表达量随患者胰酶水平的升高而增高。7.血清TSG-6蛋白表达水平检测结果显示,存活组和死亡组之间TSG-6蛋白表达水平无明显差异;按胰酶高低分组,三组患者的TSG-6蛋白表达水平也未见明显差异。结论急性百草枯中毒存活组与死亡组在基因转录水平存在差异。免疫球蛋白受体结合,趋化因子受体活性,免疫球蛋白复合物,网格蛋白包被的内吞作用,血液微粒等生物学过程和细胞因子-细胞因子受体相互作用通路,趋化因子信号通路,PI3K-AKT信号通路,代谢,DNA损伤和基因修复,细胞免疫等信号通路与百草枯中毒的致死性有关。TSG-6可能在急性百草枯中毒过程中发挥抗炎调节作用。