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随着人口老龄化的不断增加及人们生活环境的日益变化,慢性肾脏病(Chronic kidney disease,CKD)包括糖尿病肾病、高血压肾病、狼疮肾病等继发性肾病和原发性肾病的发病率逐渐升高。慢性肾脏病的病理进展比较缓慢而且具有不可逆性,早期肾脏损害的临床症状不明显。研究发现THP(Tamm-Horsfall Protein,THP)和其他新型肾功能指标如:中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(Neutrophil gelatinase-associated lipocalin,NGAL)、血清胱抑素C(Cystatin C,CysC)、血清β2微球蛋白、血清及尿液视黄醇结合蛋白等在肾脏损伤早期即可发生变化,而且尿液NGAL和THP的水平变化可反映慢性肾脏病早期肾小管损伤。但是,目前检测尿液THP的方法大多为放射免疫法,具有一定的危险性和污染性。本研究通过THP单克隆抗体的制备、纯化、鉴定,最终建立了THP的酶联免疫试验(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检验方法。收集在北京空军总医院风湿肾病科住院的慢性肾脏病患者,检测其尿液THP的含量,并采用日立7600全自动生化分析仪检测患者尿液NGAL、尿液NAG、血清CysC、血清β2-MG、血清及尿液视黄醇结合蛋白等肾功能指标含量。根据2009年改善全球肾脏疾病结局组织(Kidney Disease:Improving Global Outcomes,KDIGO)新公布的临床实践指南,结合eGFR值将慢性肾病患者进行分期,利用统计学方法分析CKD患者在不同分期中THP及各指标的含量变化。分析新型肾脏指标如,尿液NGAL、THP与传统肾功能指标如Scr、Urea等的相关性,绘制受试者特征性工作曲线判断各指标在CKD早期诊断中的准确性,并联合检测尿液NGAL和THP,观察联合预测因子在CKD肾小管损伤诊断中的准确性,为CKD的早期诊断及临床分期提供实验室依据。研究目的首先,ELISA检测方法便于操作,成本较低,没有污染。通过THP单克隆抗体的制备了解单克隆抗体制备的实验原理、主要步骤和实验方法。掌握细胞的复苏、培养、腹水纯化、抗体效价鉴定等实验室基本技术。其次,尿液thp蛋白在ckd早期肾小管损伤中变化具有临床诊断意义,通过纯化重组thp片段蛋白作为免疫原制备thp单克隆抗体,建立其elisa检测方法。最后,研究证明,尿液ngal是反映急性肾损伤的敏感指标,本文将研究尿液ngal在慢性肾脏病肾小管损伤中的诊断价值,并分析联合检测尿ngal与尿thp在早期ckd诊断中的敏感度及特异性。用统计学分析反映肾脏损伤的新型生物学指标在ckd患者不同分期中的变化并判断在慢性肾脏病早期诊断中的临床价值。检测各指标与肾小球滤过率(glomendarfiltrationrate,gfr)、血肌酐(scr)、血清尿素(urea)等传统肾功能指标的相关性,为早期诊断ckd,给予早期干预治疗延缓ckd患者的病理进展提供可靠的实验室依据。研究方法实验之前已经利用基因工程技术制备好了抗原,并以纯化的重组thp片段蛋白作为免疫原免疫小鼠,待小鼠血液抗体效价达到要求后,取脾脏。采用常规方法,使脾细胞与骨髓瘤细胞融合,获得具有分泌thp抗体的杂交瘤细胞放入液氮中保存。我将能够分泌3b9和4e4抗体的两株杂交瘤细胞复苏、培养、注入小鼠腹腔制备腹水,并将腹水用proteing方法进行纯化、检测抗体效价、用辣根过氧化物酶标记抗体并检测偶联后的效价、建立检测患者尿液thp含量的双抗体夹心的elisa检测方法。用自制的elisa试剂盒检测慢性肾脏病患者的尿液thp含量。同时采用日立7600全自动生化分析仪检测ckd患者的尿ngal、尿nag、血清cysc、血清β2-mg等肾功能指标,并收集49名健康体检人员(尿常规正常,尿蛋白阴性)作为对照组。最后对数据进行统计学分析处理。研究结果利用两株能够稳定分泌thp单克隆抗体的杂交瘤细胞株制备腹水后,腹水效价均高于1:720000,经proteing方法纯化得到thp单克隆抗体纯度大于90%,其抗体效价为4.1ng/ml左右。偶联后用elisa方法检测4e4-hrp的效价也较高,可用于检测临床标本。统计数据结果显示,尿液thp从ckd2期即与对照组和1期出现明显差异,以后各期间比较也有统计学意义,尿液ngal从ckd3a期开始于对照组比较有统计学差异。说明尿液ngal与尿液thp在ckd早期就出现变化,比传统指标scr、urea等指标更为敏感。其他生物学指标如尿液NAG、血清CysC、β2-MG等在CKD早期中的诊断价值也较高,是反映慢性肾病早期病变的良好指标。在绘制的ROC曲线中显示尿液NGAL的准确性大于尿液THP,两者的联合预测因子敏感度及特异性更高,ROC曲线下的面积为0.953。尿液THP与Scr、Urea呈负相关,随着肾小球滤过率的降低而降低。其他指标如:尿液NGAL、尿液NAG、血清CysC等与Scr、Urea呈正相关,随着肾小球滤过率的降低而增高。研究结论杂交瘤细胞复苏培养后能稳定分泌THP单克隆抗体,在体外传代后分泌抗体的能力没有改变,说明具有很好地稳定性。制备的THP蛋白单克隆抗体能够很好的识别天然THP,表明单克隆抗体的特异性较好。用两个效价较高的单抗制备双抗体夹心法检测临床标本的稳定性也较好。采用ELISA方法检测尿液THP比传统的放射免疫法更加方便、简洁。尿液THP、NGAL、血清Cys C与β2-MG可作为CKD患者早期评价GFR的敏感指标,联合NGAL、THP作联合预测因子可提高早期诊断肾损害的灵敏度及特异性,对于早期发现CKD患者肾小管损伤并评估其损害程度有重要的临床意义。