胃癌(Gastric Cancer,GC)是消化系统最常见的恶性肿瘤之一,其发病率呈逐年上升趋势,严重威胁人类的健康。全球统计数据显示,其发病率在所有恶性肿瘤中排第四位,死亡率居第三位,仅次于肺癌和肝癌。尽管目前在胃癌的诊断和治疗上取得了重大进展,早期胃癌患者的生存率得到了明显提高,但是进展期胃癌的预后仍不是很理想,远处转移仍然是胃癌患者最主要的致死原因。大量研究表明多种癌基因和抑癌基因参与了胃癌的发生发展,但是其具体的分子调控机制仍不明确。因此,更好地了解这些调控分子在胃癌发生发展过程中的作用及机制,将对胃癌临床诊断和治疗的新策略提供重要的理论基础。微小RNA(micro RNA,简称为miRNA)是近年发现的一类在生物体内广泛表达的、长约22-24nt的、高度保守的非编码调节性小分子RNA。它们可以通过抑制其靶基因m RNA的翻译或直接将其降解,在转录后水平调控基因的表达,并可以进一步调控其靶基因参与的相关信号转导通路,参与调控哺乳动物多个器官的发育过程和人类疾病的发生。一个miRNA可以调控多个基因的表达,而几个miRNA也可以调控某一个基因的表达,这说明了miRNAs及其靶分子能够形成庞大、错综复杂的生物调控网络。研究表明,miRNAs在肿瘤的发生发展过程中发挥了重要作用。在胃癌中,已发现多种异常表达的miRNAs,其参与了胃癌的发生、侵袭、转移等生物学过程,并通过调控各自不同的靶基因影响胃癌细胞的恶性生物学行为。因此,研究miRNAs在胃癌发生发展过程中的作用及机制对探索胃癌防治新策略有重要意义。miR-17-92基因簇也称为oncomiR-1,位于人类基因组的第13号染色体上C13orf25基因初级转录本的第3个内含子区,其初级转录物编码六种成熟的miRNA:miR-17,miR-18a,miR-19a,miR-19b-1,miR-20a和miR-92a-1。已有研究发现,miR-17-92基因簇在多种肿瘤中高表达,并促进肿瘤的发生发展,发挥着类似于癌基因样的作用;也有一些研究报道称miR-17-92基因簇能抑制肿瘤的进展,发挥着类似于抑癌基因样的作用。然而,目前对于miR-17-92基因簇在胃癌发生发展中的研究报道尚不多。在本研究中,我们首先以人的胃癌组织标本作为研究对象,运用q RT-PCR法检测了miR-17-92基因簇各亚单位在胃癌组织中的表达情况,并分析了其表达与胃癌临床病理学指标之间的相互关系。接下来我们通过构建稳定过表达miR-17-92的MGC-803胃癌细胞株作为研究模型,系统地研究了miR-17-92基因簇对胃癌细胞生物学功能的影响并探讨了其潜在的作用机制。最重要的是,我们运用生物信息学软件预测了miR-17-92基因簇下游的靶基因,并运用双荧光素酶报告基因实验验证了其靶向关系。我们还运用免疫组化法检测了新发现的靶基因TRAF3在胃癌组织中的表达情况,并分析了其表达与胃癌患者临床病理特征及预后的关系。本研究为miR-17-92基因簇及其靶基因在未来是否有望成为胃癌临床诊断、治疗及预后监测的生物学指标提供了理论依据。第一部分miR-17-92基因簇在胃癌组织中的表达及其与胃癌临床病理学特征的相关性分析目的明确miR-17-92基因簇在胃癌组织中的表达及其与胃癌临床病理特征的关系。方法收集2015年9月到2016年12月在苏州大学附属第一医院普外科接受胃癌根治术的患者新鲜组织标本,同时收集其临床病理资料。采用q RT-PCR方法检测miR-17-92基因簇各亚单位在胃癌组织中的表达情况。采用卡方检验分析miR-17-92基因簇各亚单位的表达与胃癌患者临床病理特征的关系。结果q RT-PCR检测结果显示miR-17-92基因簇的6个亚单位miR-17、miR-18、miR-19a、miR-19b、miR-20和miR-92在胃癌组织中的表达较其对应的癌旁正常组织均显著上调。其中,miR-17的表达水平与胃癌患者的分化程度(P=0.0031)、TNM分期(P=0.0020)相关;miR-18的表达水平与胃癌患者的TNM分期(P=0.0020)相关;miR-19a的表达水平与胃癌患者的肿瘤大小(P=0.0002)、TNM分期(P=0.0012)相关;miR-19b的表达水平与胃癌患者的肿瘤大小(P=0.0072)、TNM分期(P=0.0002)相关;miR-20的表达水平与胃癌患者的分化程度(P=0.0143)、TNM分期(P=0.0023)相关;miR-92的表达水平与胃癌患者的肿瘤大小(P=0.0374)、TNM分期(P=0.0035)相关。结论miR-17-92基因簇各亚单位在胃癌组织中的表达较其对应的癌旁正常组织均显著上调,预示着miR-17-92基因簇在胃癌的发生发展中可能扮演着癌基因样的角色。miR-17-92基因簇各个亚单位的表达水平均与胃癌患者的TNM分期呈正相关,而miR-17、miR-20的表达水平还与胃癌患者的肿瘤分化程度呈正相关,miR-19a、miR-19b、miR-92的表达水平还与胃癌患者的肿瘤大小呈正相关。第二部分miR-17-92基因簇对胃癌细胞生物学功能的影响及潜在机制探讨目的明确miR-17-92基因簇在胃癌细胞中的生物学功能及其作用机制。方法采用q RT-PCR方法检测胃癌细胞株中miR-17-92基因簇各亚单位的表达情况。采用慢病毒转染构建稳定过表达miR-17-92的MGC-803胃癌细胞株。采用CCK-8、Bru U、Cell Titer-Glo、克隆形成实验等方法检测细胞增殖;采用TUNEL实验方法检测细胞凋亡;采用流式细胞术检测细胞周期;采用划痕实验、Transwell实验方法检测细胞迁移及侵袭。采用裸鼠皮下移植瘤模型观察过表达miR-17-92对MGC-803细胞体内生长的影响。采用q RT-PCR方法检测相关基因在m RNA水平的表达。采用Western blotting方法检测相关基因在蛋白水平的表达。采用明胶酶谱实验方法检测细胞内基质金属蛋白酶的活性。采用Trans AM实验方法检测细胞内NF-κB信号通路相关分子的活性。采用Western blotting方法检测细胞内AKT、ERK1/2及NF-κB信号通路相关分子在蛋白水平的表达。结果在胃癌细胞系AGS、SGC-7901、BGC-823、MKN-45、MGC-803中,miR-17-92基因簇各亚单位在MGC-803细胞中表达量最低。在MGC-803细胞中过表达miR-17-92能够导致细胞体外生长及增殖加快、凋亡减少、迁移及侵袭能力增强。裸鼠皮下成瘤实验结果表明过表达miR-17-92能够促进MGC-803细胞的体内生长。Western blotting实验结果表明过表达miR-17-92的MGC-803细胞中p-AKT(Thr308)及p-ERK1/2表达水平较对照组细胞显著上调。Western blotting和Trans AM实验结果共同显示MGC-803-miR-17-92细胞胞核蛋白中Rel A、p50、Rel B、p52的表达活性均较MGC-803-control细胞显著上调。q RT-PCR及Western blotting实验结果显示无论是m RNA水平还是蛋白水平,MGC-803-miR-17-92细胞中促凋亡基因BIM和BID的表达水平较MGC-803-control细胞显著下调,而抑凋亡基因Bcl-2、Bcl-x L和Mcl-1的表达水平显著上调。明胶酶谱实验结果显示过表达miR-17-92能够显著增强MGC-803细胞中MMP-2的表达活性。Western blotting实验结果显示MGC-803-miR-17-92细胞中上皮细胞标志物E-cadherin、Claudin1、Ep CAM的表达水平较对照组细胞显著下调,而间质细胞标志物N-cadherin、Vimentin的表达显著上调。结论过表达miR-17-92能够显著促进MGC-803胃癌细胞的生长与增殖能力,与AKT、ERK及NF-κB信号通路的活化有关。过表达miR-17-92能够显著抑制MGC-803胃癌细胞的凋亡能力,与促凋亡基因BIM、BID的表达下调及抑凋亡基因Bcl-2、Bcl-x L、Mcl-1的表达上调有关。过表达miR-17-92能够显著促进MGC-803胃癌细胞的迁移及侵袭能力,与细胞内MMP-2活性的增高及EMT的发生相关。过表达miR-17-92能够显著促进MGC-803胃癌细胞的体内生长。第三部分miR-17-92基因簇靶基因的预测和验证目的寻找并验证miR-17-92基因簇下游的靶基因。方法运用生物信息学软件对miR-17-92基因簇的靶基因进行预测。采用q RT-PCR及Western blotting实验方法检测过表达miR-17-92的MGC-803细胞中TRAF3在m RNA水平及蛋白水平的表达。采用分子克隆实验方法构建野生型及突变型pmir GLO-TRAF3-3’UTR重组质粒。采用双荧光素酶报告基因实验检测miR-17-92与TRAF3基因3’UTR区的结合情况。采用sh RNA干扰TRAF3基因的表达构建稳定低表达TRAF3的MGC-803胃癌细胞株,采用q RT-PCR及Western blotting实验方法鉴定MGC-803细胞中TRAF3基因的敲除情况。采用Western blotting实验方法检测细胞内NF-κB信号通路相关分子蛋白水平的表达。采用Trans AM实验方法检测细胞胞核蛋白中NF-κB信号通路相关分子的活性。采用CCK-8、Cell Titer-Glo细胞活力检测试剂盒检测细胞的生长及增殖能力,采用Transwell实验方法检测细胞的迁移及侵袭能力。结果运用Target Scan软件查询miR-17-92基因簇下游的靶基因信息,发现TRAF3为miR-17-92基因簇潜在的作用靶基因之一。测序结果显示我们成功构建了野生型与突变型的pmir GLO-TRAF3-3’UTR重组质粒。双荧光素酶报告基因实验结果显示在转染pmir GLO-TRAF3-3’UTR-wild type质粒的实验组中,同时加入miR-17-92质粒的实验组与加入空质粒的对照组相比,荧光素酶活性显著下调,而在转染pmir GLO-TRAF3-3’UTR-mutant type质粒的实验组中,同时加入miR-17-92质粒的实验组与加入空质粒的对照组相比,荧光素酶活性无显著差异。q RT-PCR及Western blotting实验结果显示MGC-803-si TRAF3细胞中TRAF3在m RNA水平及蛋白水平的表达较MGC-803-sictrl细胞显著降低。敲除TRAF3后MGC-803细胞内NF-κB信号通路的活性显著增强。在MGC-803胃癌细胞中敲除TRAF3能够增强细胞的增殖、迁移及侵袭能力。结论双荧光素酶报告基因实验结果证实了TRAF3是miR-17-92基因簇直接作用的靶基因。我们在MGC-803胃癌细胞中进一步证实了TRAF3与miR-17-92基因簇的靶向关系。第四部分TRAF3在胃癌组织中的表达及其与胃癌临床病理学指标的相关性及预后分析目的明确TARF3在胃癌组织中的表达及其与胃癌临床病理特征和预后的关系。方法胃癌组织芯片(HStm A030PG03)购自上海芯超生物科技有限公司。采用免疫组化方法检测TRAF3在胃癌组织及其对应的癌旁正常组织中的表达情况。采用卡方检验分析TRAF3与胃癌患者临床病理特征的关系。运用Kaplan-Meier分析TRAF3与胃癌患者预后的关系。采用单因素和多因素方差分析来确定影响胃癌患者的预后指标。结果免疫组化结果显示TRAF3在胃癌组织中的表达显著低于其对应的癌旁正常组织。TRAF3的表达与胃癌患者的肿瘤大小(P=0.036)、浸润深度(P=0.003)及TNM分期(P=0.009)相关。Kaplan-Meier生存分析结果提示TRAF3低表达组胃癌患者的总生存期显著短与TRAF3高表达组胃癌患者(P=0.002)。单因素方差分析结果提示胃癌患者的肿瘤大小(P=0.009)、分化程度(P=0.033)、淋巴转移(P=0.032)、远处转移(P=0.000)、TNM分期(P=0.001)及TRAF3的表达(P=0.002)均是影响胃癌患者预后的重要指标;多因素方差分析结果提示TRAF3(P=0.004)并不是影响胃癌患者预后的独立指标,其他指标包括肿瘤大小(P=0.010)、远处转移(P=0.000)及TNM分期(P=0.010)均是影响胃癌患者预后的重要指标。结论TRAF3在胃癌组织中的表达较癌旁正常组织呈相对低表达。TRAF3的表达与胃癌患者的肿瘤大小、浸润深度及TNM分期呈负相关。TRAF3的表达与胃癌患者的预后呈正相关,即TRAF3低表达组胃癌患者与TRAF3高表达组患者相比有较短的生存期。TRAF3可以作为胃癌患者预后判断的指标之一。