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目的: 采用PCR结合DGGE技术的分子生物学手段检测种植体周围炎及种植体周围黏膜炎龈下微生物群落的多样性;研究种植体周围炎及种植体周围黏膜炎龈下微生物种类、数量以及群落分布,找出特异性微生物;分析种植体龈沟微生物群落分布对种植体周围软硬组织的影响,为从微生态学角度揭示种植体周围炎的发病机制提供基础研究资料,为临床判断种植体健康状况及选择适当的临床维护与干预方法提供依据。 方法: 收集2010年9月至2012年9月于成都军区机关医院口腔科接受Bego柱形种植义齿修复的病例,共纳入Bego柱形种植体34枚。其中,种植体周围炎(A组)10例,种植体周围黏膜炎(B组)10例,再随机纳入健康种植体(C组)14例作为对照组。检测种植体周的主要临床指标并采集种植体周龈沟液,提取龈沟微生物群落总DNA,采用细菌的16S rDNAV3区通用引物进行PCR扩增,扩增产物再进行DGGE电泳分析。将电泳胶中的共性条带和特异性带切胶回收后克隆测序,所得结果提交GeneBank进行比对,确定菌属种类并构建系统发育树,同时进行光密度半定量分析,分析种植体周围炎及种植体周围黏膜炎龈下微生物群落的多样性及其分布特点。 结果: 1.临床指标分析结果 1) mPLI、GBI指数随着种植体周围组织从健康状态到炎症状态逐渐增高,A组和B组明显大于C组(P<0.01);B组与C组的PPD、BL指数均小于A组(P<0.01);B组PIGT指数与A组、C组均无统计学差异(P>0.05),但A组PIGT指数大于C组,差异有统计学意义(P<0.05)。 2) PIGT与mPLI、GBI、BL三指数无显著相关性(P>0.05),PIGT与PPD间存在显著正相关关系(P<0.01)。 2.种植体龈沟液定量检测结果 A组与B组的PICF量无统计学差异(P>0.05),A组和B组PICF量均高于C组PICF量,且差异有统计学意义(P<0.01) 3.样本总DNA提取及PCR-DGGE结果 1)采用TIANamp Micro DNA Kit试剂盒法提取龈沟液微生物样本总DNA,大部分样本的OD260/OD280比值在1.7-1.8之间,DNA浓度在32-48ng/μl之间。 2)样本16S rDNA V3区PCR产物经水平琼脂糖电泳检测,片段长度约220bp,条带均一且亮度较高,扩增效果理想。 3) DGGE图谱显示三组龈沟液样本中微生物群落均存在高度多样性,多样性指数(Shannon、Simpson、S、EH)无统计学差异(P>0.05)。 4) UPGMA聚类分析三组样本微生物群落整体相似性为11%,A组各样本相似性为34.2%-58.6%,B组各样本相似性为29.9%-60.2%,C组各样本相似性为30.8%-74%。 4.测序及半定量分析结果 1)A组检出6个菌门,包括25种菌属,特有菌门为放线菌门和螺旋体门;B组检出5个菌门,包括15种菌属,其中包含一种未获培养的细菌克隆,特有菌门为Candidate division TM7;C组检出4个菌门,包括12种菌属。 2)A组G-厌氧杆菌比例为73.21%;B组G-厌氧杆菌比例为69.65%;C组G-厌氧杆菌比例为64.51%。A组中二氧化碳嗜纤维菌属、卟啉单胞菌属、梭杆菌属比例较高,此外还检出放线菌属和密螺旋体属;B组中梭杆菌属、牙龈卟啉单胞菌属、韦荣菌属比例较高,此外还检出Candidatedivision TM7菌门。 结论: 本研究发现: 1.种植体周mPLI、GBI、PPD和BL从健康状态到炎症状态呈逐渐升高的趋势,mPLI和GBI在发生种植体周围黏膜炎时开始增高,PPD和BL在发生种植体周围炎时明显增高。 2.种植体二期修复时的软组织厚度对后期探诊深度有直接影响,基线水平越高,则后期探诊深度越大;PICF量可以在一定程度上反映种植体周围组织的炎症程度;滤纸条法能有效采集较高质量的种植体周围龈沟液样本。 3.健康种植体、种植体周围黏膜炎及种植体周围炎三者间龈沟液微生物群落组成及分布有较大差异。梭杆菌属、卟啉单胞菌属、韦荣氏菌属在种植体周围黏膜炎龈沟液微生物群落中占优势地位,Candidate divisionTM7菌门仅在种植体周围黏膜炎龈沟液中检出。二氧化碳嗜纤维菌属、卟啉单胞菌属、梭杆菌属在种植体周围炎龈沟液微生物群落中占优势地位,放线菌属和密螺旋体属仅在种植体周围炎龈沟液中检出。 4.种植体周围龈下微生物群落与种植体周围炎症的发生和发展有密切关系,随着种植体周围组织炎症程度的加重,G-厌氧杆菌的比例呈逐渐升高的趋势。