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第一部分REGγ基因真核表达质粒的构建及其稳定转染细胞株的建立目的:构建REGgamma（REGγ）基因的真核表达重组体pcDNA3.1-REGγ,并建立稳定转染REGγ基因的乳腺（癌）细胞株,为进一步深入研究REGγ基因的功能奠定基础。方法:提取MCF-7细胞的总RNA为模板,通过RT-PCR获取全长REGγcDNA,经限制性内切酶EcoRI、EcoRV酶切后与pcDNA3.1连接构建重组体。以Lipofectamine2000将重组体导入HBL-100、MCF-7、MDA-MB-231细胞,由G418筛选出稳定转染细胞株。并经免疫细胞化学、细胞免疫荧光、Western Blot、RT-PCR等方法检测各株细胞的REGγ表达。结果:经内切酶酶切及DNA序列分析证实重组体构建成功。经免疫细胞化学、细胞免疫荧光、Western Blot、RT-PCR等检测证实稳定转染细胞株中其REGγ的表达与未转染的同种细胞相比均明显增强,有显著性差异（P＜0.01）;REGγ在乳腺癌细胞株的表达明显高于乳腺上皮细胞株（P＜0.05）;在两株乳腺癌细胞株中,MDA-MB-231表达的REGγ高于MCF-7（P＜0.05）。结论:真核表达重组体pcDNA3.1-REGγ构建成功,并经抗生素筛选获得了稳定高表达REGγ的细胞株,为进一步研究REgγ的功能奠定了基础。同时发现在乳腺癌细胞株中REGγ的表达明显高于乳腺上皮细胞株;在乳腺癌细胞株中,恶性潜能高的细胞株REGγ的表达高于恶性潜能低的细胞株。第二部分REGγ基因在人乳腺癌细胞中的功能研究目的:探讨REGγ基因对乳腺癌细胞增殖、凋亡及其对癌基因的影响。方法:通过软琼脂集落形成试验、采用噻唑蓝（MTT）比色法、流式细胞仪（FCM）检测REGγ对细胞增殖及细胞周期的影响;免疫细胞化学检测增殖细胞核抗原（proliferative cell nuclear antigen,PCNA）、bcl-2、fas、c-myc的表达;分光光度法检测Caspase-3活性变化;AnnexinV-FITC的FCM检测来了解细胞凋亡的变化;以透射电子显微镜（TEM）观察转染REGγ引起的细胞超微结构改变;Western Blot检测REGγ对其靶蛋白p21和SRC-3及癌基因CyclinD1的影响。结果:MTT法及FCM检测提示,增加REGγ表达可使细胞生长加速、细胞倍增时间缩短、S+G2+M的增殖期细胞数明显增加。软琼脂集落形成实验表明,转染REGγ基因的细胞集落形成率高、克隆形成时间短、克隆存活时间长。PCNA的免疫细胞化学检测结果显示,转染REGγ基因的细胞PCNA表达明显增强（p＜0.01）。Caspase-3分光光度法检测显示,实验组细胞的OD值普遍低于对照组（p＜0.05）;Annexin V-FITC的FCM检测显示,实验组细胞的凋亡率明显低于对照组（p＜0.01）;免疫细胞化学检测发现,转染REGγ基因的细胞表达bcl-2增强（p＜0.05）、表达fas减弱（p＜0.05）、表达c-myc增强（p＜0.05）;TEM观察转染REGγ基因的细胞表现为核仁肥大,线粒体、高尔基体丰富或扩张,未见凋亡小体形成;Western Blot检测发现转染REGγ基因的细胞,其p21和SRC-3表达减弱（p＜0.05）、但癌基因CyclinD1表达增强（p＜0.01）。结论:REGγ基因能促进乳腺癌细胞的生长及增殖,抑制乳腺癌细胞凋亡。其机制可能与REGγ基因参与了细胞增殖和细胞凋亡基因的调控有关。第三部分转染REGγ基因对乳腺癌细胞裸鼠移植瘤生长的影响目的:研究REGγ基因转染乳腺癌MDA-MB-231细胞后在裸鼠体内的成瘤作用及其机制。方法:以稳定高表达REGγ基因的细胞株为实验组、转染空载体及未施加处理因素的细胞为对照组。将此3组细胞接种于裸鼠皮下,观察移植瘤的生长状况并计算抑瘤率;RT-PCR检测REGγ基因在瘤组织中的表达;FCM检测瘤组织的肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）中CD16的表达及肿瘤细胞周期和细胞凋亡;免疫组化检测移植瘤中p21的表达。结果:与对照组比较,实验组移植瘤生长速度较快、体积较大、瘤重增加（P＜0.05）;RT-PCR检测显示REGγ基因在瘤组织中的表达增加（P＜0.01）;FCM检测提示CD16阳性率明显降低,G0/G1和G2/M期细胞减少,S期细胞明显增多,肿瘤细胞的凋亡率明显降低（P＜0.05）;P21的表达明显降低（P＜0.05）。结论:REGγ基因在体内具有促进乳腺癌发生、发展的作用,其机制可能与其具有加速细胞周期、抑制细胞凋亡,抑制NK细胞活化以及对p21的特异性降解有关。