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生物毒素是指来源于生物又不可自复制的一大类具有毒害作用的化学物质。其中,相思子毒素（Abrin）和黄曲霉毒素B1（AFB1）都具有强烈毒性。它们一旦进入人体就会对人类的生命健康造成严重的威胁及伤害。目前针对Abrin和AFB1的研究大多集中于建立毒素含量的检测方法,而对用于检测生物体损伤的适用性较弱。因此,建立一种从分子生物学水平上研究毒素毒性作用的新方法,对探索毒素引起的细胞凋亡以及监测细胞凋亡进程具有重要意义。金纳米材料自身具有优异的光学性质,已经被广泛应用于食品安全、分析化学和生物医学领域。金纳米材料可以作为表面增强拉曼散射（Surface-Enhanced Raman Scattering,SERS）的基底,具有超高的灵敏度,已经实现了单细胞水平上的无标记生物传感,尤其是多枝角金纳米材料,由于“热点”较多,拉曼增强性能更好。同时,金纳米材料又是良好的荧光淬灭剂。将拉曼与荧光结合,可实现多模式可视化监测细胞生物学过程。本课题基于金纳米材料的光学特性,制备了无标记的拉曼探针和有标记的拉曼-荧光双模式纳米传感器,分别用作细胞凋亡的定性表征和标志物的定量检测,为深入研究毒素诱导的细胞凋亡提供了思路。具体研究内容如下:1.基于金纳米星（Gold nanostars,AuNSs）实时原位监测Abrin诱导的细胞凋亡的SERS研究。为实现实时原位监测细胞凋亡进程,在75±5 nm的AuNSs上修饰巯基聚乙二醇（Methoxy polyethylene glycol thiol,mPEG-SH）和细胞穿膜肽（Cell penetrating peptide,TAT）,构建无标记功能化SERS探针以直接增强细胞本身的拉曼信号。以Abrin诱导细胞损伤,细胞损伤不同时间（0 h、2 h、4 h、8 h、12 h和24 h）内细胞内物质的变化,通过SERS光谱进行表征,运用差谱分析直观比较相邻损伤时间段内细胞内物质变化的具体情况,结合主成分分析（Principal component analysis,PCA）识别和区分细胞的不同状态,并揭示细胞凋亡过程中的典型事件。实验结果显示,Abrin诱导细胞损伤0 h24 h内,细胞内物质变化主要表现为蛋白质和DNA损伤。2.基于SERS-荧光双模式纳米传感器实时原位定量检测活细胞中的细胞色素c（Cytochrome c,Cyt c）。在原位监测细胞凋亡的基础上,实现检测特定凋亡标志物的激活具有重要意义。Cyt c作为细胞凋亡早期的重要标志物,被认为是细胞凋亡中的无回归点。基于此,通过SERS和荧光共振能量转移（Fluorescence resonance energy transfer,FRET）实现活细胞中Cyt c的定量检测。在金三角片（Gold nanoplates,AuNTs）上修饰Cyt c的适配体,通过互补配对准则连接上修饰有拉曼信标和荧光基团磺酸基-Cy5羧酸（Cy5）的互补链,构建SERS-荧光双模式纳米传感器。AuNTs同时提供增强Cy5拉曼信号和淬灭其荧光的作用。以AFB1诱导细胞凋亡。在最优条件下,Cy5的SERS和荧光强度与活细胞中的Cyt c在0.044μM9.95μM的浓度范围内均呈现良好的线性关系,检测限（Limit of detection,LOD）可达0.021μM。且特异性和通用性良好。与酶联免疫吸附试验（Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）结果相比,该方法定量检测活细胞内Cyt c的误差小于10%。3.基于SERS-荧光双模式纳米传感器实时原位检测活细胞中的半胱氨酸蛋白酶3（caspase 3）。在实现检测特定凋亡标志物激活的基础上,实时追踪凋亡信号的传导,能为细胞凋亡的研究提供更多详细信息。Caspase 3作为Cyt c的下游凋亡因子,被认为是细胞凋亡中最主要的终末剪切酶。基于此,将caspase 3特异性识别的十二肽的N端修饰上拉曼信标和荧光基团罗丹明B（Rhodamine B,Rb）后,通过C端半胱氨酸上的巯基（-SH）与AuNTs连接,构建SERS-荧光双模式纳米传感器。AuNTs提供增强Rb的拉曼信号和淬灭其荧光的作用。活性caspase 3会特异性切断十二肽中的识别位点,导致Rb SERS信号的减弱和荧光信号的恢复。在最优条件下,Rb的SERS和荧光强度与活性caspase 3在0.05 nM50 nM的浓度范围内均呈现良好的线性关系,LOD可达0.001 nM。仍选择AFB1诱导表达caspase 3的细胞凋亡。当胞质内的Cyt c达到一定含量时,caspase 3就会被激活。在特定的活细胞内实现了该传感器的应用。