[目的]肿瘤微环境除了肿瘤细胞以外,还有其周围基质,主要由间质细胞、免疫炎性细胞、细胞因子、趋化因子、微血管等组成的局部病理环境,既为肿瘤提供生长环境,也为肿瘤细胞与微环境相互作用提供场所,而间质细胞在肿瘤赖以生长的微环境中扮演着重要角色。近年来有研究报道,肿瘤细胞本身的遗传学改变决定着一部分肿瘤的发生,而另一部分则来自于肿瘤微环境改变的结果。已经有研究证实,肿瘤微环境中的间质细胞在肿瘤中所发挥的作用广泛存在于人类的许多肿瘤中,其通过某些基因和特异细胞因子的异常表达参与和调节肿瘤的发生发展的诸多过程：并且来自于子宫内膜间质细胞的细胞因子诱导子宫内膜癌分化,并抑制其生长增殖。然而,其在子宫内膜癌中的异常表达和潜在性生物学效应以及涉及的信号通路仍待进一步探讨和确定。PTEN (Phosphatase and tensin homology on chromosome ten)基因是第一个具有双特异性磷酸酶活性的的抑癌基因,通过磷脂酰肌醇3磷酸(phosphatidylinositol-3-phosphate, PIP3)去磷酸化,从而阻止细胞生长,并促进细胞发生凋亡,抑制癌前病变及癌的发生,在肿瘤的发生发展中发挥重要的作用,包括在子宫内膜癌中广泛选择低表达。Ras基因是一种最常见的原癌基因,与肿瘤的生成,增殖、迁移、扩散、血管形成密切相关。在人类的各种肿瘤包括子宫内膜癌中广泛选择高表达。肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor, HGF),最早被命名为肝细胞的有丝分裂剂,主要由间质细胞产生,为异二聚体结构,是一种具有多种生物学功能的重要的细胞因子。其生物学活性由单一受体c-Met (c-metproton cogene product)介导。c-Met,也叫MET和肝细胞生长因子受体(HGFR),是具有酪氨酸激酶活性的一种膜受体,通常表达上皮来源的细胞。HGF与c-Met结合激活受体,自身发生磷酸化,引起细胞内一系列信号传导途径的级联激活,在不同的细胞和组织中可以诱导出不同的反应。有研究表明,在人类的许多肿瘤中HGF/c-Met/Akt信号通路可以通过Akt激活来调节肿瘤细胞的增殖和分化,在一系列肿瘤包括子宫内膜癌中普遍存在信号转导异常。本研究着重于通过创建癌间质细胞与正常上皮细胞体外的共培养体系和体内的动物模型实验,探索子宫内膜腺癌间质细胞(Carcinoma interstitial cells, CIC)与来源于子宫内膜正常上皮细胞(Normal epithelial cells, NEC)之间的交互作用,同时探讨PETN和RAS基因在癌间质细胞与正常上皮细胞共培养微环境中的异常表达；更进一步地探讨肿瘤微环境中HGF的介导作用,研究它们相互作用所涉及的信号通路,明确子宫内膜腺癌(endometrial carcinome, EC)的间质细胞及旁分泌因子在肿瘤进展中所发挥的关键作用,为提高患者生存,选择合适的治疗靶点提供有用的信息。[方法]本研究建立了子宫内膜腺癌间质细胞和正常子宫内膜上皮细胞的原代细胞共培养,构建了一个旁分泌模型作为模拟子宫内膜腺癌间质细胞与正常上皮细胞之间的交互作用,用于检测子宫内膜腺癌间质细胞对正常子宫内膜上皮细胞增殖及肿瘤微环境中旁分泌因子HGF的介导作用,并着重研究它们可能涉及的信号分子通路和它们之间的相互作用。1、组织标本收取和原代细胞分离培养1)、临床组织标本获取：临床组织样本取自华中科技大学同济医学院附属协和医院和慕尼黑工业大学附属伊萨右岸医院妇科肿瘤中心住院的32例子宫内膜腺癌手术患者和48例阴道流血的育龄期患者,其中21例阴道流血的患者最终的组织病理学诊断为分泌期子宫内膜,而27例阴道流血的患者最终的组织病理学诊断为增生期子宫内膜。所有患者手术前6个月内未接受激素治疗,样本的获取及实验目的均获得患者本人及家属的知情同意,所有操作已经过两国医学伦理委员会审核批准。2)、原代细胞分离和培养：将分离获取的子宫内膜腺癌组织和正常子宫内膜组织用胶原酶进行消化,得到子宫内膜腺癌间质细胞和正常子宫内膜上皮细胞与间质细胞,使用波形蛋白(vimentin)抗体并分别通过免疫细胞化学方法对细胞进行鉴定。3)、免疫细胞化学：分别将置于培养皿中获得的子宫内膜腺癌间质细胞(CIC)、正常上皮细胞(NEC)和正常间质细胞(NIC)三组细胞爬片,用于免疫细胞化学检测。4%多聚甲醛固定10分钟破膜,用5%NGS(正常山羊血清)溶液孵育30min封闭,加入兔抗人波形蛋白(vimentin)作为一抗,4℃过夜后,加入HRP标记的二抗。使用DAB进行显色反应,适时终止反应。苏木素复染30sec。各级酒精(70%、80%、90%、95%、100%)脱水,每级5min。中性树胶封片,显微镜观察并拍片。每个标本分别由两名观察者独立评估。用PBS代替一抗,作为阴性对照组。将标本采用免疫组化的方法对染色的强度和阳性细胞数进行评分,免疫组化染色评分=染色强度得分×阳性染色细胞百分比得分。2、子宫内膜腺癌间质细胞对正常上皮细胞增殖的影响1)、细胞间接共培养：采用间接共培养将子宫内膜腺癌间质细胞接种在6孔共培养板的下室,用来提供旁分泌因子,将正常子宫内膜上皮细胞接种于另一6孔共培养板的上室滤膜上,培养1-5天,单独培养的腺癌间质细胞被作为对照组。2)、细胞生长曲线的测定：使用细胞生长曲线测定细胞增殖情况。将腺癌间质细胞和正常上皮细胞接种在96孔板中共培养,每天每组三复孔,按7天接种细胞。待4h细胞贴壁,加入CCK-8试剂,于37℃,5%CO2孵箱中放置1h,酶标仪测定450nm处的吸光度,用以确定细胞实际的起始密度,作为生长相对零点。将检测7天的数据进行处理用Excel绘出细胞增殖曲线。3)、Brdu掺入分析：通过检测BrdU的掺入能够了解细胞在S期的比例和增殖情况。采用免疫荧光方法来分析细胞中的BrdU掺入率。将正常上皮细胞接种于备好的六孔板中,孔中放置已接种腺癌间质细胞的小室,在选定的时间点吸去培养液,加入BrdU培养液,用PBS清洗,加盐酸(HC1)变性,加硼酸钠溶液中和,加BSA/PBS室温封闭,在盖玻片四周用隔水笔划边界,中间划线分为两半,大的一半加BrdU抗体稀释,小的一半加PBS/BSA,湿盒内4℃C过夜,取出六孔板中的盖玻片,细胞面朝下贴于载玻片上,显微镜观察、拍照。4)、细胞RNA提取：采用TRIzol (Invitrogen)试剂抽提RNA。将六孔板中每孔加入TRIzol试剂裂解细胞,室温放置,加入氯仿离心,用移液器吸取上清放入RNA FREE的试管中,加入不同处理因素,用酶标仪检测RNA的浓度和纯度,-80℃冰箱保存。5)、RNA逆转录cDNA:采用M-MLV逆转录酶(Promega)进行cDNA合成。在无核酸酶的PCR管中依次加入RNA, Random Primer, Nuclease-Free H20试剂,将PCR管置于PCR仪中加热、冷却,在反应体系中再加入不同试剂,置于PCR仪中,孵育、灭活。6)、实时定量PCR.通过PCR反应发出的荧光检测反应体系中的荧光信号强度,进而确定PCR产物的含量。采用SYBR(?) Premix Ex TaqTM (Perfect Real Time)试剂盒(TaKaRa Biotechnology Co., Ltd. Dalian, China)进行实时定量PCR反应,操作仪器使用Thermal Cycler DiceTM Real Time System(TP800实时荧光定量PCR仪,TaKaRa)。定量PCR的扩增产物长度参照说明书要求,以80bp-150bp最为合适(可以延长至300bp)。荧光的阈值和本底信号采用实验仪器的默认数值,每个反应管内所采集到的荧光信号强度达到设定的闽值(基线荧光强度的10倍)时所处的循环数定义为Ct值；实验中每个样本平均做3复孔,目的基因的表达水平用2-AACt表示。分析了反应产物1.5%琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭。每个产品的序列被自动测序证实。7)、蛋白印记法(WB)分析：使用蛋白裂解液将蛋白进行裂解,4℃离心收集培养细胞。再将蛋白提取物经电泳、转膜、封闭,分别经过一抗、二抗孵育,TBST洗涤,最后再经压片、显影、定影,采用ODYSSEY红外成像系统扫膜,保存图像。8)、流式细胞分析(FCM)细胞周期：通过流式细胞仪完成的一种针对单个细胞进行定量分析的技术。用胰酶消化培养的细胞,转移到流式专用管中,室温离心,弃上清,收集细胞。加入预冷的乙醇固定细胞,置于-20℃冷冻保存。配制上样缓冲液,重悬细胞,室温避光保存10min。通过相应波长的激发光作用,PI发出的荧光强度与DNA含量成正比,以荧光强度为横坐标,细胞数为纵坐标,利用流式细胞仪分析软件可以得出各细胞样本中每个周期的细胞数目。9)、裸鼠皮下成瘤实验：在4周龄的雄性BLAB/c nu裸鼠肩部皮下接种培养细胞,每只裸鼠一侧接种2×106细胞,右侧接种共培养的正常子宫内膜间质细胞和上皮细胞,左侧接种共培养的子宫内膜腺癌间质细胞和正常上皮细胞,互为对照。待出现肉眼可见的肿瘤后,对瘤体的大小定期采用游标卡尺进行测量,肿瘤体积计算参照此公式：V=长*宽*宽/2。3、子宫内膜腺癌间质细胞的旁分泌作用1)、酶联免疫吸附试验(ELISA):将共培养腺癌间质细胞和正常上皮细胞接种至24孔板,对细胞采用不同的干预,依次加入一抗、二抗、显色底物及终止液,用ELISA kit检测培养上清中HGF和PGF2a的含量,读取对450nm波长的光吸收值。2)、免疫组化(IHC)：将进行免疫组织化学检测的组织样本包括子宫内膜腺癌(32例)和正常子宫内膜组织(48例),经石蜡包埋后,切片、脱蜡、水化,操作根据生产厂商说明进行,使用双盲方法对结果进行随机选择和分析。每个标本分别由两名观察者独立评估。用PBS代替一抗,作为阴性对照组。根据标本阳性细胞数和染色强度进行评分,免疫染色评分=染色强度得分×阳性染色细胞百分比得分。4、HGF在上皮细胞增殖中的作用机制1)、蛋白免疫印迹(WB)：使用蛋白裂解液将蛋白裂解,4℃离心收集培养细胞。将蛋白提取物依次按照电泳、转膜、封闭,一抗(p-Akt, β-catenin, p-ERK1/2, p-NF-kB, β-actin)低温过夜,二抗孵育30分钟。采用ODYSSEY红外荧光成像系统扫膜,保存图像。2)、细胞生长曲线的测定：使用细胞生长曲线测定细胞增殖情况。将腺癌间质细胞和正常上皮细胞接种在96孔板中共培养,每天每组三复孔,按7天接种细胞。待4h细胞贴壁,加入CCK-8试剂,于37℃,5%CO2孵箱中放置1h,酶标仪测定450nm处的吸光度,用以确定细胞实际的起始密度,作为生长相对零点。将检测7天的数据进行处理用Excel绘出细胞增殖曲线。3)、实时定量PCR：采用SYBR(?) Premix Ex TaqTM (Perfect Real Time)试剂盒(TaKaRa Biotechnology Co., Ltd. Dalian, China)进行实时定量PCR反应,操作仪器使用Thermal Cycler DiceYM Real Time System (TP800实时荧光定量PCR仪,TaKaRa).定量PCR的扩增产物长度参照说明书要求,以80bp-150bp最为合适(可以延长至300bp)。荧光的阈值和本底信号采用实验仪器的默认数值,每个反应管内所采集到的荧光信号强度达到设定的阈值(基线荧光强度的10倍)时所处的循环数定义为Ct值：实验中每个样本平行做3复孔,目的基因的表达水平用2-AACt表示。引物序列见表2。分析了反应产物1.5%琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭。每个产品的序列被自动测序证实。5、统计学分析：所得统计数据使用SPSS16.0软件进行方差分析(美国芝加哥,IL)。结果采用均数±标准差的形式表示,至少有三个独立的实验。通过t检验或方差分析进行两组或多组的比较,以P<0.05认为有显著性差异。[结果]1.原代细胞分离培养和免疫细胞化学1.1来源于腺癌组织的间质细胞呈长条状,排列紊乱；来源于正常组织的间质细胞呈梭形,排列整齐。1.2细胞角蛋白(cytokeratin)和波形蛋白(vimentin)分别是子宫内膜间质细胞和上皮细胞的特征性蛋白。从正常子宫内膜组织中分离获取的上皮细胞和间质细胞进行鉴定,其中上皮细胞cytokeratin阳性而vimentin阴性：间质细胞则cytokeratin阴性而vimentin阳性,纯度达到95%以上；从子宫内膜腺癌组织中分离得到的间质细胞经免疫细胞化学鉴定,结果与正常间质细胞类似,cytokeratin阴性而vimentin阳性,细胞纯度达到95%以上。2.子宫内膜腺癌间质细胞的旁分泌作用能够促进上皮细胞增殖2.1细胞间接共培养的方式模拟体内的旁分泌作用实验显示,与腺癌间质细胞共培养的上皮细胞增长快于与正常间质细胞共培养的上皮细胞(P<0.05)。提示腺癌间质细胞分泌的某种因子对上皮细胞的增殖有促进作用。2.2BrdU掺入的实验显示,与腺癌间质细胞共培养的上皮细胞处于增殖期的比例多于与正常间质细胞共培养的上皮细胞(P<0.05)2.3定量PCR结果表明,抑癌基因PTEN和癌基因K-Ras以及内参基因β-actin都拥有锐利、单一的溶解曲线,表明所设计引物具有良好的特异性。从基因表达水平来看,正常子宫内膜间质细胞、子宫内膜腺癌间质细胞两组的PTEN mRNA表达水平逐渐下降,而Ras mRNA表达水平逐渐上升。说明子宫内膜腺癌间质细胞释放的旁分泌因子能够使子宫内膜上皮细胞的的抑癌基因PTEN表达水平下降,而癌基因K-Ras表达水平上升,从而使正常子宫内膜上皮细胞发生恶性转换。2.4通过免疫印迹(WB)数据分析,正常子宫内膜间质细胞、子宫内膜腺癌间质细胞两组中的PTEN表达水平逐渐下降,而Ras表达水平逐渐上升,与mRNA表达水平变化趋势一致。2.5免疫细胞化学(ICC)的数据分析显示,用免疫细胞化学的方法对共培养的上皮细胞进行染色来观察两个蛋白的表达水平。结果显示,正常子宫内膜间质细胞、子宫内膜腺癌间质细胞两组的PTEN蛋白表达水平逐渐下降,而K-Ras蛋白表达水平逐渐上升,与Western和qPCR趋势一致。在显微镜下选取上中下左右五个视野进行染色阳性细胞计数统计阳性率,结果表明PTEN阳性率在第二组(NE+CI)下降明显,而K-Ras的阳性率在第二组(NE+CI)明显升高,结果有统计学意义(P<0.05)。2.6细胞周期检测结果显示,与癌间质细胞共培养的上皮细胞G0/G1期比例降低,而S期和G2/M期细胞比例增加,表明该组细胞分裂较旺盛,增殖加快(P<0.05)。2.7实时荧光定量PCR(RT-PCR)的方法检测下游基因Cyclin D1结果显示,与腺癌间质细胞共培养的上皮细胞Cyclin D1表达水平较高,提示细胞增殖加快(P<0.05)。2.8通过实时荧光定量PCR的方法观察p21和p27基因的表达水平,结果显示,p21和p27基因在两个共培养组之间表达水平均没有明显变化(P>0.05)。表明与腺癌间质细胞共培养的上皮细胞周期改变与p21、p27的作用无明显关联。2.9裸鼠皮下移植瘤的实验结果可以看出,与腺癌组织间质细胞共培养的上皮细胞增殖速度比与正常子宫内膜间质细胞共培养的上皮细胞快,瘤体大。在观察期内,与腺癌组织共培养的上皮细胞移植瘤体积及重量都明显大于与正常子宫内膜间质细胞共培养的上皮细胞。3、子宫内膜腺癌间质细胞的旁分泌作用3.1酶联免疫吸附(ELISA)实验,将共培养72hr的细胞培养液用ELISA方法检测其中的HGF和PGF2a水平。结果显示,第二组(NE+CI)共培养液中HGF的浓度明显高于第一组(NE+NI)(P<0.001); PGF2a的浓度也明显高于第二组(P<0.001)。3.2采用实时荧光定量PCR和蛋白印迹的方法检测两种间质细胞中HGF的基因表达水平。结果表明,腺癌间质细胞中HGF的基因和蛋白表达水平都明显高于正常子宫内膜间质细胞,提示腺癌组织间质细胞中HGF由于基因表达上调,进而合成更多的HGF并分泌至细胞外(P<0.01)。由于PGF2a是不饱和脂肪酸,无法检测其基因表达水平。3.3采用实时荧光定量PCR和蛋白印迹的方法检测子宫内膜腺癌移植瘤中HGF表达,结果显示,与腺癌组织间质细胞共培养的上皮细胞形成的移植瘤中HGF的基因和蛋白表达水平都明显高于与正常子宫内膜间质细胞共培养的上皮细胞(P<0.05)。结果进一步表明,癌间质细胞在与上皮细胞共培养的过程中HGF的表达明显上调,可能是上皮细胞增殖加快的原因。3.4采用免疫组化的实验方法检测正常及子宫内膜腺癌组织中HGF的表达水平。结果表明,子宫内膜腺癌组织的HGF表达水平明显高于正常子宫内膜组织。3.5通过细胞增殖曲线来观察HGF对正常子宫内膜上皮细胞的影响。结果表明,在培养液中加入细胞因子HGF,能够促进单独培养的正常子宫内膜上皮细胞的增殖,趋势与共培养的情况类似。表明细胞因子HGF具有刺激上皮细胞增殖的作用。4、HGF在上皮细胞增殖中的作用机制4.1采用蛋白印迹(WB)的方法进行信号通路节点的筛选,检测几个常见的与增殖相关的信号节点分子(β-catenin、Akt、ERK、NF-k B)的活化水平,筛选后发现Akt的磷酸化水平在与癌间质共培养时有所增加,其他信号通路分子则无明显变化。提示旁分泌的HGF可能通过激活Akt信号通路发挥作用。4.2采用蛋白质印迹(WB)观察信号通路分子Akt的磷酸化情况。实验结果发现,HGF刺激可以引起信号通路分子Akt活化,而Met抑制剂加入后Akt磷酸化水平降低,而腺癌间质共培养组整体信号通路分子Akt的磷酸化水平比正常间质共培养组高,而Met抑制剂加入后也能够降低Akt的磷酸化水平。说明是腺癌间质的促增殖作用是通过旁分泌HGF因子,并通过HGF-Akt信号通路实现的。同时通过细胞生长曲线检测细胞增殖能力,结果观察到HGF信号通路的抑制能够逆转腺癌间质细胞旁分泌的促增殖作用,进一步证实癌间质细胞旁分泌的促增殖作用是通过HGF信号通路发挥作用的。4.3通过蛋白质印迹(WB)和PCR实验提取瘤体组织总蛋白,检测Akt及其磷酸化水平的变化。结果显示,与腺癌间质细胞共培养的瘤体中Akt磷酸化水平明显高于与正常子宫内膜间质细胞共培养的上皮细胞,表明瘤体内Akt信号通路活化水平较高(P<0.01)。4.4采用实时荧光定量PCR的方法进一步检测小鼠移植瘤体内Cyclin D1基因的表达水平。结果表明,与腺癌间质细胞共培养的移植瘤内Cyclin D1表达水平较高,提示细胞增殖加快(P<0.05)。[结论]1.通过体内外实验研究证实,子宫内膜腺癌间质细胞与正常子宫内膜上皮细胞共培养能够促进正常上皮细胞的增殖。2.子宫内膜腺癌间质细胞与正常子宫内膜上皮细胞共培养导致正常上皮细胞中抑癌基因PTEN表达下降,而癌基因K-Ras表达上升。3.子宫内膜腺癌间质细胞通过基因表达上调,合成、分泌细胞生长因子HGF,作用于正常上皮细胞的增殖过程。4.HGF、c-Met的过度表达与子宫内膜腺癌的发生发展密切相关。5.HGF、c-Met可促进肿瘤细胞的增殖。6.子宫内膜腺癌间质细胞通过HGF/AKT/CyclinDl信号通路调控正常上皮细胞的增生。7.阻断HGF/c-Met的表达或信号转导系统可作为子宫内膜腺癌治疗的新靶点。