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鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium, S. typhimurium)属于沙门氏菌属B群,是一群宿主非特异性肠道致病菌,具有广泛的宿主谱和致病性,能致各种动物及人的副伤寒,常引起人类食物中毒和医院内感染。在兽医、医学和公共卫生上都具有十分重要意义。基于耐药性和食品安全方面的考虑,疫苗接种免疫是本病防控的一个理想选择。目前在一些国家已使用鼠伤寒沙门氏菌活疫苗,并取得了一定的效益,但这些疫苗株是经化学诱变法获得,对其致弱的遗传背景不清晰,且存在毒力返强的风险,用此突变株制备疫苗,其质量和安全性难以保证。因此,如何获得安全性好、免疫原性强的活菌疫苗以有效抵抗鼠伤寒沙门氏菌的感染已成为迫在眉睫的问题。cya基因(adenylate cyclase, cya)编码合成腺苷酸环化酶,crp基因(cAMP receptor protein, crp)编码cAMP的受体蛋白,是沙门氏菌的重要毒力调节基因。已有研究报道鼠伤寒沙门氏菌cya、crp双基因缺失株的毒力明显降低,但保留了良好的免疫原性。基于crp、cya基因的已知序列,本研究运用重组自杀性质粒介导细菌的等位基因交换技术获得鼠伤寒沙门氏菌SL1344株crp和cya缺失突变菌株,并对其生物学特性进行比较研究。主要研究内容有以下几个方面:1.鼠伤寒沙门氏菌SL1344株crp、cya基因的克隆分析参照鼠伤寒沙门氏菌LT2株crp、cya基因序列,从鼠伤寒沙门氏菌SL1344株基因组模板中扩增出crp、cya基因,与GenBank上登录的鼠伤寒沙门氏菌LT2、伤寒沙门氏菌Ty2和肠炎沙门氏菌p125109的crp、cya基因保持较高的同源性。2.重组自杀性质粒pREΔcya的构建以鼠伤寒沙门氏菌SL1344基因组为模板,分别扩增cya上下游片段并将其克隆入自杀性质粒pRE112上,转化大肠杆菌χ7213细胞,构建含缺失1182 bp的cya基因重组自杀性质粒pREΔcya。3.缺失菌株ΔcrpSL1344、ΔcyaSL1344的筛选与鉴定以大肠杆菌χ7213 (pREΔcrp或pREΔcya)为供体菌,SL1344为受体菌进行接合转移。利用等位交换技术两步法筛选crp和cya基因缺失菌株,通过PCR鉴定和测序证实缺失菌株ΔcrpSL1344、ΔcyaSL1344构建成功。4.缺失菌株ΔcrpSL1344、ΔcyaSL1344生物学特性比较研究对两个缺失菌株的表型、生长特性、耐药性、遗传稳定性及对雏鸡的毒力等生物学特性进行比较研究。结果发现两个缺失菌株之间的表型、生长特性、耐药性和遗传稳定性没有明显差别。与SL1344相比,两个缺失菌株的血清型没有发生变化;但均失去了利用麦芽糖、丙三醇和山梨醇等碳源的能力,不能分解H2S,保留了利用鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、甘露醇的能力,其他常规生化特性和耐药性与亲本菌株SL1344一致;并且生长速度明显缓慢;能够分别稳定遗传缺失的crp和cya基因。雏鸡毒力试验表明ΔcrpSL1344和ΔcyaSL1344毒力较SL1344毒力分别降低约21574倍和16706倍。本研究利用自杀性质粒介导细菌等位基因交换技术,成功构建了鼠伤寒沙门氏菌的缺失菌株ΔcrpSL1344、ΔcyaSL1344,为深入研究鼠伤寒沙门氏菌crp基因、cya基因与其致病力之间的相互关系提供了一种新方法,并为研制更加安全有效的鼠伤寒沙门氏菌疫苗弱毒株以及进一步将其开发为适于黏膜免疫的口服疫苗活载体奠定了基础。