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实验目的喉癌是耳鼻咽喉头颈外科常见的恶性肿瘤,约占全身恶性肿瘤的1%～5%,居第11位。近年来喉癌发病率有明显的增长趋势,严重危害着人类健康。目前对喉癌的治疗实行综合治疗,即根据肿瘤的生物学行为,通过手术、放疗、化疗、生物治疗等手段的合理应用,达到最大程度消灭肿瘤、保留喉功能、提高患者生存率和生存质量的目的。虽然随着诊断和治疗技术的不断提高,治疗后的生存时间以及喉功能的保留都有明显提高,但对于晚期及复发患者的治疗效果仍不尽如人意。因此早期发现、早期治疗、寻找新的有效的治疗药物以及减少对正常组织的损害成为迫切需要解决的问题。近年来从基因水平和信号传导途径入手研究肿瘤的发生机制,发现除了人们所熟知的DNA序列异常外,表观遗传学(epigenetics)改变在肿瘤的发生中也起到十分重要的作用。表观遗传学是研究DNA序列没有变化,但是表达改变可遗传的新兴学科,基因组印记是其重要研究内容之一。后者是指控制某一表型的一对等位基因由于亲源不同而差异性表达,是一种遗传后的基因调控方式。如果抑癌基因的一个等位基因发生印记,那么失去抑癌功能只需有一个等位基因失活,这样就增加了肿瘤易感性。人类染色体11p15.5是重要的肿瘤抑制基因存在部位,包含了许多印记基因,CDKN1C(p57kip2)基因就在其中。CDKN1C基因通过与细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin-dependent kinases,CDKs)结合及抑制CDKs的功能使细胞周期停止在G1期,对细胞的生长有着极其重要的调控作用,并且在某些肿瘤中存在基因异常和蛋白表达下降,提示CDKN1C与肿瘤发生、发展有着密切的联系。在正常情况下,CDKN1C基因是你源基因印记,母源基因表达。目前大多数研究表明。CDKN1C基因在人类肿瘤中突变少见,主要发生杂合性缺失(loss of heterozygosity,LOH)、印记缺失(loss of imprinting,LOI)或印记错误以及CpG岛的异常甲基化(Aberrantmethylation)等,从而导致基因表达下降,甚至缺失。为了探讨喉癌中CDKN1C基因的杂合性和印记状态,本实验在基因内部和下游各选取一个微卫星位点TH01和D11S2359,在基因内部选取一个酶切位点rs3852522,采用PCR、RT-PCR、聚丙烯酰胺凝胶电泳-银染及酶切等方法对选定位点进行检测,以揭示其中的分子生物学机制及内在联系,在基因水平上为LSCC的早期诊断提供新的思路,早期发现高危人群,早期干预。材料和方法一、实验材料40例喉癌标本取自中国医科大学附属盛京医院耳鼻咽喉科2007年5～12月间手术切除病例,男性35例,女性5例,年龄57.84±9.84岁,所有病例均经病理诊断为喉鳞状细胞癌。根据国际抗癌联盟(UICC)2002年TNM分期标准进行分型分期。正常对照11例取白喉癌旁＞2cm处正常喉黏膜组织(取自全喉切除和喉大部切除病例)。所有患者手术前均未接受系统的放疗或化疗。标本提取均经中国医科大学附属盛京医院伦理委员会批准,并签署患者知情同意书。二、实验方法(一)PCR引物序列TH01(146-190 bp):Forward:5’一GTGGGCTGAAAAGCTCCCGATTAT-3’Reverse:5’.GTGATTCCCATTGGCCTGTTCCTC-3’D11S2359(197-221 bp):Forward:5’-TCCTCTCACAAAAATTGATGG-3’Reverse:5’.CTAACCTGACATTGTGCACA-3’rs3852522(391 bp):Forward:5’-GCGAACCCGACGCAGAAGAG-3’Reverse:5’-GCATGTCCTGCTGGAAGTCGTAATC-3’(二)CDKN1C基因杂合性检测抽提基因组DNA,PCR扩增TH01和D11S2359片段,产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳,硝酸银染色,拍照,判断结果,筛选出杂合子。(三)RT-PCR抽提杂合子组织RNA,反转录反应合成cDNA,扩增酶切位点片断,检验扩增产物。(四)CDKN1C印记状态检测使用FspBI酶对杂合子cDNA扩增产物进行酶切,产物进行琼脂糖凝胶电泳。(五)统计学分析采用SPSS12.0统计软件进行分析。采用x~2检验,Fisher确切概率法(FisherExact Test),检验水准为双侧P＜0.05差异有显著性意义。结果一、TH01和D11S2359扩增长度TH01和D11S2359的PCR扩增产物所需要长度分别为146-190bp和197-221bp,根据半对数表法计算出TH01两条等位基因的长度分别为158bp和170bp,D11S2359的两条等位基因长度为200bp和218bp。二、CDKN1C基因TH01和D11S2359位点LOH情况在CDKN1C基因上选取2个微卫星位点,即TH01和D11S2359进行杂合性检测。结果在40例喉癌组织中共有18例(45%)至少在一个微卫星位点上检测到LOH,其中在TH01位点共观察到9例存在LOH,占22.5%(9/40);在D11S2359位点共观察到14例存在LOH,占35.0%(14/40);两点共有5例同时缺失,缺失率为12.5%(5/40)。而在正常对照组中,仅在D11S2359位点上检测到1例存在LOH,占9.1%(1/11),与喉癌组织中存在显著性差异(P=0.037＜0.05)。在Ⅱ期喉癌中出现LOH 37.5%(3/8),Ⅲ期喉癌中出现LOH 21.4%(3/14),Ⅳ期喉癌中出现LOH 66.7%(12/18)(表4),三者之间存在显著性差异(p=0.034＜0.05)。在声门上型喉癌中出现LOH 60.0%(12/20),声门型喉癌中出现LOH 33.3%(6/18),声门下型喉癌中出现LOH 0.0%(0/2),三者之间没有统计学差异(p=0.108＞0.05)。三、CDKN1C基因的印记状态CDKN1C基因cDNA扩增区带为391bp,PCR扩增产物用FspBI酶切,未消化的为a片段(391bp),消化的是b片段(253bp和138bp),含有a和b片段为双等位基因表达(印记缺失),仅含有a或b片段者为单等位基因表达。22例杂合子肿瘤标本中有13例CDKN1C双等位基因表达(59.1%)。非病变组织10例杂合子中有2例为双等位基因表达(20.0%)。喉癌组织的CDKN1C基因通过双等位基因表达印记缺失,但喉癌组织的CDKN1C印记状态与正常组织无显著性差异(P=0.060＞0.05)。结论1、在LSCC的发生发展中,CDKN1C基因TH01和D11S2359位点出现频繁的LOH,可能是其功能失调的重要原因之一。2、LSCC中存在一定比例的CDKN1C基因印记缺失,但该基因印记状态与肿瘤的关系和正常组织相比并没有显著差异。3、CDKN1C基因发生状态改变的原因除LOH外,应该还存在其它机制。