论文部分内容阅读
南方水稻黑条矮缩病是威胁我国水稻生产的重要病毒病害之一,由南方水稻黑条矮缩病毒(Southern rice black-streaked dwarf virus, SRBSDV)引起。该病毒属于呼肠孤病毒科(Reoviridae)斐济病毒属(Fijivirus)。主要由迁飞性的白背飞虱(Sogatella furcifera)以持久增殖型方式传播,不经卵传播,白背飞虱一旦获毒则终身带毒；灰飞虱(Laodelphax striatellus)也可以带毒,但不能传毒。水稻一旦发生该病即没有有效药物或方法进行治疗,而且发病植株将作为侵染源被介体白背飞虱向周围健康水稻传播病毒,将加重田间的病害发生。因此需及时检测田间水稻和介体昆虫的带毒情况,尽早拔除发病植株,灭杀田间介体昆虫,从而阻断病害的扩散。目前检测病毒的方法较多,常用RT-PCR法检测SRBSDV,但该方法存在操作复杂、耗时、成本高等缺陷,不适用于大批量样品的检测。为了建立快速、简便、特异性的病毒检测技术,本研究优化了免疫捕获反转录扩增(Immunocapture reverse transcription, IC-RT-PCR)和逆转录环介导等温扩增(Reverse transcription loop-mediared isothermal amplification, RT-LAMP)体系,用于检测水稻和介体昆虫中的SRBSDV。通过对免疫捕获抗体的筛选,明确SRBSDV P9-1蛋白的多克隆抗体可用于免疫捕获反转录扩增检测技术,用于捕获水稻或介体昆虫中的病毒,从而捕获病毒RNA,用于RT-PCR检测病毒。通过对环介导等温扩增技术Mg2+浓度、dNTP浓度、反应温度以及钙黄绿素用量的优化,建立了适合检测SRBSDV的RT-LAMP检测方法,并将RT-LAMP方法应用于检测2013年不同地区采集到的水稻病样和介体昆虫的带毒率。此外,本研究通过原核表达蛋白制备了RBSDV编码蛋白P9-1的多克隆抗体,Western blot实验表明所制备的抗体可特异性检测RBSDV侵染水稻中的P9-1蛋白,并可通过IC-RT-PCR方法检测RBSDV侵染的褐飞虱。通过对检测方法的比较,本研究所建立的RT-LAMP较IC-RT-PCR方法灵敏。由于IC-RT-PCR不需要提取RNA,避免了提取单头昆虫RNA的困难,因此比较适用于单头飞虱带毒检测；而RT-LAMP方法可同步进行反转录和PCR,与常规RT-PCR方法比较缩短了检测时间,因此适用于水稻样品的快速检测。本研究对RT-LAMP和IC-RT-PCR检测方法的优化丰富了水稻病毒的检测技术,有利于田间水稻病毒病害的监测和诊断。