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第一章5-杂氮-2’-脱氧胞苷对香烟提取物所致小鼠肺气肿模型和干细胞抗原-1表达的影响目的：探讨经腹腔注射香烟提取物(Cigarette Smoking Extract,CSE)所致肺气肿小鼠模型的建立,腹腔注射5-杂氮-2’-脱氧胞苷(5-aza-2’-deoxycytidine, AZA)对肺气肿动物模型的保护作用和对干细胞抗原-1(Stem Cell Antigen-1, Sca-1)表达的影响。方法：32只4-6周龄的雄性C57BL/6J小鼠随机分为正常对照组(N组)、AZA (A组)、CSE+AZA (AC组)及CSE(C组),每组8只,定时定量腹腔注射CSE溶液/AZA溶液/PBS溶液,第28天处理四组小鼠,检测体重变化、Buxco系统及PLY3211小动物肺功能检测系统行肺功能检查、收集标本。肺组织病理切片苏木素-伊红(HE)染色后观察形态学改变并定量测定平均肺泡隔厚度(MAST)、平均内衬间隔(MLI)及肺泡破坏指数(DI),肺组织TUNEL染色检测肺泡间隔细胞凋亡。将动物模型于造模第28天处死,密度梯度离心法分离小鼠骨髓EPCs并培养7天,Western Blotting检测各组EPCs及肺组织Sca-1蛋白表达,实时定量RT-PCR检测各组EPCs及肺组织Sca-1mRNA表达。结果：(1)(i)4组小鼠体重变化均无统计学差异(P>0.05)。(ii)肺功能比较中,与正常对照组比较,AC组及C组小鼠气道阻力(Raw)显著增高(P<0.01),动态肺顺应性(Cdyn)、呼气峰流速(PEF)及吸呼比(Ti/Te)降低(P<0.05或P<0.01),AC组和C组之间肺功能各指标无统计学差异(P>0.05)。(iii)小鼠肺组织HE染色,形态学变化明显,C组肺组织可见肺实质破坏,肺泡间隔断裂,肺泡壁变薄,肺泡腔融合、高度扩大,肺气肿明显。各组MAST比较：与N组比较,A组、AC组和C组MAST均显著降低(P<0.01)；与A组比较,AC组和C组MAST显著降低(P<0.01)；与AC组比较,C组MAST降低(P<0.05)。各组MLI比较：与N组比较,A组、AC组和C组MAST增高(P<0.05或P<0.01)；与A组比较,AC组和C组MAST显著增高(P<0.01)；与AC组比较,C组MAST增高(P<0.05)。各组DI比较：与N组比较,A组、AC组和C组MAST均显著增高(P<0.01)；与A组比较,AC组和C组MAST显著增高(P<0.01)；与AC组比较,C组MAST增高(P<0.05)。(iv)肺组织TUNEL染色,与N组比较,AC组和C组AI显著增高(P<0.01)；与A组比较,AC组和C组AI显著增高(P<0.01)；与AC组比较,C组AI显著增高(P<0.01)。(2)(i)各组EPCs的Sca-1蛋白表达比较：与N组比较,AC组和C组Sca-1蛋白表达量显著降低(P<0.01)；与A组比较,AC组Sca-1蛋白表达量降低(P<0.05),C组Sca-1蛋白表达量显著降低(P<0.01)；与AC组比较,C组Sca-1蛋白表达量显著降低(P<0.01)。(ii)各组EPCs的Sca-1mRNA表达比较：与N组比较,AC组和C组Sca-1mRNA表达量显著降低(P<0.01)。与A组比较,AC组和C组Sca-1mRNA表达量显著降低(P<0.01)。与AC组比较,C组之间Sca-1mRNA表达量降低(P<0.05)。(iii)各组肺组织的Sca-1蛋白表达比较：与N组比较,A组、AC组和C组Sca-1蛋白表达量均显著降低(P<0.01)；与A组比较,AC组和C组Sca-1蛋白表达量显著降低(P<0.01)；与AC组比较,C组Sca-1蛋白表达量显著降低(P<0.01)。(iv)各组肺组织的Sca-1mRNA表达比较：与N组比较,A组、AC组和C组Sca-1mRNA表达量显著降低(P<0.01)。与A组比较,AC组和C组Sca-1mRNA表达量显著降低(P<0.01)。与AC组比较,C组Sca-1mRNA表达量降低(P<0.05)。结论：(1)腹腔内注射CSE可成功建立小鼠肺气肿模型,缩短建模周期,且肺部形态学改变早于功能改变。(2)去甲基化剂可能通过部分逆转CSE对骨髓EPCs及肺组织Sca-1表达的抑制作用,而发挥对肺气肿动物模型肺功能和肺组织形态学的保护作用。(3)表观遗传学DNA甲基化机制参与了肺气肿的发病机制。第二章5-杂氮-2’-脱氧胞苷对香烟提取物所致内皮祖细胞功能及其干细胞抗原-1表达的影响目的：观察干细胞抗原-1(Stem Cell Antigen-1, Sca-1)在正常小鼠内皮祖细胞(Endothelial Progenitor Cells, EPCs)上的表达,以及5-杂氮-2’-脱氧胞苷(5-aza-2’-deoxycytidine, AZA)对香烟提取物(Cigarette Smoking Extract,CSE)所致EPCs功能及其Sca-1蛋白表达的影响。方法：采用密度梯度离心法分离小鼠骨髓EPCs并培养；通过观察细胞形态学改变、对培养第7天的贴壁细胞行DiI-acLDL摄取及FITC-UEA-I结合双染鉴定及流式细胞术检测细胞表面标志物,综合鉴定EPCs;采用流式细胞术检测EPCs上Sca-1的表达。采用不同浓度和不同干预时间,用CSE溶液、AZA溶液体外干预培养7天的小鼠EPCs,采用噻唑蓝比色法(MTT法)检测EPCs增殖能力,选择最佳干预浓度和干预时间进行后续干预试验。采用贴壁细胞计数检测EPCs粘附能力,培养液中NO浓度测定检测EPCs分泌能力。将培养第7天的EPCs分为四组：正常EPCs组(对照组,N组),2umol/L AZA干预组(A组),1%CSE+2umol/L AZA干预组(AC组)和1%CSE干预组(C组),采用western-blot检测各组Sca-1蛋白表达。结果：(1)培养7天的EPCs呈梭形、纺锤形或多边形,可形成首尾相连网状血管样结构,亦可呈铺路石样外观。其DiI-acLDL摄取及FITC-UEA-I结合双染阳性率为(94.67±4.16)%,其特异性表面抗原FITC-CD34、PE-CD133、APC-Flk-1三阳表达率为(95.07±1.73)%,加上PerCP-Sca-1后的四阳表达率(94.00±1.67)%,其中EPCs的Sca-1阳性表达率为(98.87±0.24)%。(2)(i)不同浓度和不同时间CSE干预后EPCs增殖能力比较：CSE干预3小时,与对照组比较,1%CSE和2.5%CSE组细胞OD值显著增加(P<0.05),5%CSE和10%CSE组细胞OD值显著下降(P<0.01)；CSE干预6小时,与对照组比较,1%CSE组细胞OD值显著增加(P<0.05),2.5%CSE、5%CSE和10%CSE组细胞OD值显著下降(P<0.01)；CSE干预24小时,与对照组比较,各CSE浓度干预均使细胞OD值下降(P<0.01)。(ii)选择1%CSE和干预24小时时间点,比较不同浓度5-azaC干预后的EPCs增殖能力：与对照组比较,1%CSE组,1%CSE+2umol/L AZA组,1%CSE+5umol/LAZA组细胞OD值均下降(P<0.05)；与1%CSE组比较,1%CSE+2umol/L AZA组,1%CSE+5umol/L AZA组细胞OD值增加(P<0.05);1%CSE+2umol/L AZA组,1%CSE+5umol/L AZA组细胞OD值差异无统计学意义(P>0.05)。(iii)选择1%CSE+2umol/LAZA和干预24小时时间点,比较各组EPCs粘附能力和分泌能力：对照组(N组)、1%CSE+2umol/L AZA组(AC组)和1%CSE组(C组),EPCs贴壁细胞计数比较为：与N组比较,AC组和C组贴壁细胞数显著降低(P<0.01),与AC组比较,C组贴壁细胞数显著降低(P<0.01)。对照组(N组)、1%CSE+2umol/L AZA组(AC组)和1%CSE组(C组),EPCs培养液中NO浓度比较为：与N组比较,AC组和C组浓度显著降低(P<0.01),AC组和C组之间无统计学差异(P>0.05)。(3)正常EPCs组(对照组,N组),2umol/L AZA干预组(A组),1%CSE+2umol/L AZA干预组(AC组)和1%CSE干预组(C组)4组EPCs上Sca-1蛋白表达比较：与N组比较,C组Sca-1蛋白表达显著降低(P<0.01),AC组及A组Sca-1蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)；与C组比较,N组,AC组,A组Sca-1蛋白表达均显著上升(P<0.01)；AC组和A组之间Sca-1蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)。结论：(1)小鼠EPCs高表达Sca-1基因。(2)短时间低浓度的CSE干预使得EPCs的增殖功能代偿性增强,延长干预时间和／或提高干预浓度都将使EPCs的功能降低,甚至完全抑制,呈时间和浓度依赖。(3)DNA甲基化转移酶抑制剂能部分逆转CSE对EPCs上Sca-1蛋白表达的抑制作用,同时改善EPCs的功能,EPCs上Sca-1蛋白表达和EPCs功能改变趋势一致,提示DNA甲基化参与了EPCs功能受损机制,Sca-1DNA甲基化可能参与了EPCs功能受损机制。