京大戟、甘遂、狼毒为大戟科大戟属的同科同属植物,京大戟为大戟科植物大戟Euphorbia pekinensis Rupr.的干燥根、甘遂为大戟科植物甘遂Euphorbia kansui T.N Wang的干燥根、狼毒为大戟科植物月腺大戟Euphorbia ebracteolata Hayata或狼毒大戟Euphorbia fischeriana Steud的干燥根。临床上这三种中药均被归为峻下逐水药,治疗各种水肿。其生品药性峻猛,均有毒,具刺激性,使用不当可产生强烈的腹痛、腹泻、便血等消化道毒性反应。临床应用均需炮制。自宋代开始,京大戟、甘遂、狼毒均用醋炮制以缓和其毒性,且醋制法一直沿用至今。此三种有毒中药同科同属,毒性表现、炮制方法及临床应用均相似,但其明确的毒性成分及醋制后毒性成分的变化未见有报道。近年来,萜类成分作为毒效成分一直是大戟科植物的研究热点。有研究报告认为,二萜酯类成分可能与大戟科大戟属植物的毒性相关。文献研究显示,京大戟、甘遂、狼毒中也均含有二萜酯类成分。京大戟中含Casbane烷型和松香烷内酯型二萜；甘遂中主要存在巨大戟醇型和假白榄酮型二萜：狼毒中存在松香烷内酯型和巨大戟醇型二萜。这类成分的共性之处在于均具有成酯基团。文献研究也曾报道某些大戟科植物中的二萜酯类成分的成酯基团与毒性相关。早在十九世纪就有学者提出“植物化学分类”和“比较植物化学”概念。20世纪以来,国内外越来越多的学者致力于植物系统发育与其化学成分关系的研究,但同科同属植物的化学成分与炮制解毒是否具有相关性一直未见有报告。本课题组前期研究天南星科有毒中药炮制解毒机理时发现,同科同属中药的毒性成分与炮制解毒具有相似规律,而本课题中京大戟、甘遂、狼毒同属于大戟科大戟属,且毒性相似,因此,认为大戟科大戟属中药的毒性化学成分之间必然存在某种相似性。本论文根据课题组提出的假说,针对“醋制可缓解大戟科大戟属有毒中药毒性”的传统炮制方法,从醋制减毒出发,分别对京大戟、甘遂、狼毒(月腺大戟)醋制前后的胃肠道刺激性毒性和化学成分进行比较,找寻共性毒性成分。研究发现,京大戟、甘遂、狼毒(月腺大戟)胃肠道刺激性毒性表现相似,且醋制后可明显缓和刺激性毒性作用；初步研究发现三种有毒中药的共性成分与萜类成分极性极为相似,醋制前后也发生明显变化；采用胃肠道刺激性毒性评价模型,初步确定京大戟、甘遂、狼毒的最强刺激性泻下部位；质谱分析结果显示最强刺激性泻下部位中存在大量二萜类成分。此研究结果为共性毒性成分的分离并解析醋制前后共性毒性成分的构效变化奠定基础。主要的工作内容包括以下几个方面：1、大戟科大戟属有毒中药的胃肠道刺激性毒性研究依据临床中毒症状,分别采用两种整体模型(小鼠小肠推进运动实验、单次大剂量给药后小鼠消化系统脏器病理切片检查实验)和两种细胞模型(刺激巨噬细胞释放NO含量测定实验、对肠粘膜上皮细胞(IEC-6)毒性实验)评价大戟科大戟属三种有毒中药醋制前后的胃肠道刺激性毒性。实验结果显示,京大戟、甘遂、狼毒(月腺大戟)生品可明显促进小鼠小肠运动并增强巨噬细胞释放NO的能力；病理切片结果显示对消化道系统未见明显器质性病变,且对肠粘膜上皮细胞无明显的增殖抑制作用。因此,将促进小鼠小肠推进运动和刺激巨噬细胞释放NO的能力作为大戟科大戟属三种有毒中药胃肠道刺激性毒性的评价指标。另对京大戟、甘遂、狼毒(月腺大戟)70%醇提取物进行醋制前后的胃肠道刺激性毒性比较,结果显示,与生品组相比,醋品组对小鼠小肠推进率均明显降低且刺激巨噬细胞释放NO的能力均减弱,即醋制可缓和京大戟、甘遂、狼毒的胃肠道刺激性毒性。2、大戟科大戟属有毒中药共性毒性成分的初步研究采用薄层色谱分析,以萜类成分(大戟二烯醇)作为对照,在环己烷：乙酸乙酯(8.5：1.5)展开条件下,10%硫酸乙醇显色条件下,发现Rf=0.5处,京大戟、甘遂、狼毒生品及醋品与对照品均清晰显示相同的紫红色斑点,表明大戟科大戟属三种有毒中药中存在与萜类成分极性相似的成分,即含有共性萜类成分。利用制备薄层将可能的共性萜类成分分离,结合高效液相色谱法进行醋制前后共性萜类成分的比对分析,发现三种有毒中药中的共性萜类成分经醋制后色谱峰峰面积发生明显变化,出现峰面积明显增加或减少的现象,亦有新的色谱峰出现,或色谱峰完全消失,即醋制对大戟科大戟属三种有毒中药中的共性萜类成分产生显著影响。3、大戟科大戟属有毒中药不同极性部位的胃肠道刺激性毒性及化学成分的研究将大戟科大戟属三种有毒中药70%醇提取物根据极性的不同依次分为石油醚部位、二氯甲烷部位、乙酸乙酯部位和水部位。采用小鼠小肠推进运动实验和刺激巨噬细胞释放NO含量测定实验对各部位醋制前后的胃肠道刺激性毒性进行比较,结果显示,京大戟、甘遂、狼毒(月腺大戟)生品不同极性部位对促进肠蠕动和刺激巨噬细胞释放NO的能力强弱一致,均表现为：京大戟——乙酸乙酯部位>石油醚部位>二氯甲烷部位>水部位；甘遂——乙酸乙酯部位>石油醚部位>二氯甲烷部位>水部位；狼毒——石油醚部位>二氯甲烷部位>乙酸乙酯部位>水部位。同时,京大戟醋制后的石油醚和乙酸乙酯部位的加速肠蠕动作用及刺激巨噬细胞释放NO的能力明显下降；甘遂醋制后的二氯甲烷和乙酸乙酯部位加速肠蠕动作用明显下降,石油醚和乙酸乙酯部位刺激巨噬细胞释放NO的能力明显下降；狼毒醋制后的石油醚和二氯甲烷部位加速肠蠕动作用明显下降,石油醚部位刺激巨噬细胞释放NO的能力明显下降。两种模型综合分析,初步确定京大戟乙酸乙酯部位、甘遂乙酸乙酯部位和狼毒石油醚部位是胃肠道刺激性毒性最大且醋制后刺激性毒性明显下降的部位。利用薄层色谱分析京大戟、甘遂、狼毒醋制前后共性萜类成分的存在部位。发现大戟科大戟属三种有毒中药的石油醚部位、二氯甲烷部位、乙酸乙酯部位均含有与萜类成分极性相似的共性成分,水部位中未见此类成分。因此,将京大戟、甘遂、狼毒的石油醚部位、二氯甲烷部位和乙酸乙酯部位作为共性毒性成分的存在目标,进行高效液相色谱分析,结果显示京大戟的乙酸乙酯部位化学成分醋制前后变化最大；甘遂的二氯甲烷和乙酸乙酯部位变化明显；狼毒的石油醚部位和乙酸乙酯部位变化最大。综合胃肠道刺激性毒性和化学成分的分析结果,将京大戟的乙酸乙酯部位,甘遂的乙酸乙酯部位,狼毒的石油醚部位确定作为代表大戟科大戟属三种有毒中药强胃肠道刺激性泻下毒性的主要部位。4、大戟科大戟属有毒中药中共性萜类成分的研究考察三萜成分大戟二烯醇是否为大戟科大戟属三种有毒中药的共有毒性成分。以HPLC法测定京大戟、甘遂、狼毒醋制前后大戟二烯醇的含量,同时以两种细胞模型(刺激巨噬细胞释放NO含量测定实验和对小肠粘膜上皮细胞的毒性实验)评价大戟二烯醇的胃肠道刺激性毒性。含量测定实验结果显示,京大戟中大戟二烯醇的含量(8.11～10.59mg·g-’)明显高于甘遂(1.53-1.96mg.g-1),狼毒中未检出大戟二烯醇,且醋制对京大戟、甘遂中的大戟二烯醇含量无显著影响。毒性研究结果显示,大戟二烯醇能够刺激巨噬细胞释放NO,但与同等剂量条件下的京大戟、甘遂、狼毒生品70%醇提物相比,其作用效果远远小于后者,说明大戟二烯醇刺激巨噬细胞释放NO的能力微弱,同时,其对小肠粘膜上皮细胞的抑制率为0,结合醋制前后的含量测定结果,表明三萜成分大戟二烯醇不是导致京大戟、甘遂、狼毒胃肠道刺激性毒性的主要成分。同时,结合化学成分的相关文献资料,采用液质联用技术,通过己知二萜类化合物的分子量,对京大戟、甘遂、狼毒的强胃肠道刺激性泻下部位中的二萜类成分进行初步鉴定。实验结果显示,京大戟生品乙酸乙酯部位中共鉴定出1种casbane型二萜(Pekinenal);和3种松香烷内酯型二萜(Helioscopinolide、Helioscopinolide B、Helioscopinolide C),其中casbane型二萜(Pekinenal)和[M+H]+=317.1472的松香烷内酯型二萜(Helioscopinolide、 Helioscopinolide B)经醋制后消失。甘遂生品乙酸乙酯部位中共鉴定出9种巨大戟醇型二萜(20-O-(2’E,4’E-decadienoyl)ingenol、20-O-(2’E,4’Z-decadienoyl)ingenol、3-O-(2’E,4’ Z-decadienoyl)ingenol、3-O-(2’E,4’E-decadienoyl)ingenol、5-O-(2’E,4’E-decadienoyl) ingenol、3-O-(2’E,4’Z-decadienoyl)-5-O-acetylingenol、3-O-(2’E,4’Z-decadienoyl)-20-O-acetyl-ingenol、3-O-(2’E,4’E-decadienoyl)-20-O-acetylingenol、5-O-(2’E,4’Z-decadienoyl)-20-O-acetylingenol),其中[M+Na]+=521.328的分子离子峰经醋制后消失和3种假白榄酮型二萜(Kansuinin A、Kansuinine H、Kansuinin F),其中[M+Na]+=799.359分子离子峰(Kansuinin F)经醋制后消失。狼毒生品石油醚部位中共鉴定出3种松香烷型二萜(Jolkinolide B、ebraeteolatanolide B、ent-11β-hydroxyabiera-8(14)、13(15)-dien-16,12β-olide)和4种巨大戟醇型二萜(Ingenol-3(20)-myristinate、Ingenol-3(20)-palmitate)。因此,表明京大戟、甘遂、狼毒的胃肠道刺激性毒性与其含有的二萜类成分相关。本课题通过对大戟科大戟属代表性有毒中药京大戟、甘遂、狼毒的研究,基于植物化学分类学理论,从共性毒性成分出发,进行毒性成分追踪,以胃肠道刺激性毒性模型不断缩小三种有毒中药中胃肠道刺激性毒性成分的存在范围,研究表明大戟科大戟属三种有毒中药的共性毒性成分与二萜类成分明显相关,醋制后含有二萜酯类成分的部位毒性明显下降。本课题的研究将促进基于植物化学分类学理论的炮制共性技术与机理的进一步深入探讨。