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胎儿对于母体而言是半异己的异体移植物，因此理论上，母体应该对胎儿发生免疫排斥反应，但通常这种情况并没有发生。故而母胎免疫耐受机制，这一直是人们研究的热点。
树突状细胞(Dendritic Cell，DC)是一类专职的抗原提呈细胞，能有效刺激初始T细胞活化、增殖，处于启动、调控并维持免疫应答的中心环节。此外，DC还在诱导免疫耐受过程中扮演关键角色，具有调控免疫应答尤其是免疫耐受的作用，DC主要是通过诱导T细胞无能或低能反应、诱导T细胞凋亡和外周反应性T细胞清除、诱导CD4+CD25+调节性T细胞产生等机制引起免疫耐受。其作用与DC类型，成熟状态有关。有研究表明DC对妊娠子宫局部免疫的调节作用会直接地影响着母胎之间的相互作用。DC的起源、类型、成熟度、表型及其功能都具有明显的多样性和异质性。机体内存在不同类型的DC亚群，这些亚群负责不同的功能。
体内DC均起源于多能干细胞，主要分为髓系DC(myebiod，MDC/ DC1)和淋巴系DC(lymphoid，LDC/PDC/ DC2)。DC有非成熟和成熟两种。近年来研究发现人早孕期蜕膜中存在HLA—DR+Linl—(CD3-CD19-CD14-CD56-CD16-) DC，为非成熟型，MDC。虽然正常妊娠后外周血中MDC和PDC的百分率及MDC/DC比率均出现降低，但脐带血DC绝对数高于妊娠前外周血，MDC百分率仍高于PDC。复发性自然流产(recurrent spontaneous abortion，RSA)蜕膜中CD83+DCs高于正常妊娠。提示DC在RSA病因中有一定作用。
CD4+CD25+调节性T细胞(regulatory T cell，Treg)是机体以“主动”方式获得和维持自身免疫耐受的一种重要细胞。最近有学者指出，母胎免疫平衡的建立和维持与CD4+CD25+Treg细胞的免疫抑制功能密切相关。有学者报道CD4+CD25+ Treg细胞在人类妊娠早期显著升高，一定数量的CD4+CD25+ Treg细胞在维持正常妊娠中发挥着重要的作用；URSA的发生与CD4+CD25+ Treg细胞的减少有关；URSA患者在未孕时已存在CD4+CD25+ Treg细胞的异常表达，及免疫功能的紊乱。
对于建立和维持母胎免疫耐受、以及耐受被打破以致流产的机制，目前尚不完全清楚。已有研究表明，母胎界面局部免疫细胞是从外周被募集而来，并非由前体细胞在子宫内膜自我更新而来，而趋化因子及其受体在母胎界面局部免疫细胞的招募和分化过程中起着始动和关键作用，参与胚胎种植时母胎界面的免疫反应。已知CD4+CD25+Trg细胞大量表达趋化因子受体CCR4，CCR4与其配体CCL17、CCL22的相互作用，在CD4+CD25+ Treg T细胞的分布和募集中起到重要作用，有研究报道具有免疫耐受作用的DC可以表达CCL17和CCL22。鉴于以上几点我们推测可能母胎界面的DC是也是通过大量表达趋化因子受体CCR4的配体CCL17和CCL22，优先吸引CD4+CD25+ Treg T细胞而维持母胎界面的免疫微环境。但正常妊娠前后DC是否表达CCL17和CCL22，表达是否存差异?80％不明原因性习惯性流产与免疫紊乱有关，URSA流产患者DC是否表达CCL17和CCL22，与正常妊娠前后表达是否存差异，目前尚未有相关报道。本研究检测正常早孕、正常未孕和URSA流产蜕膜或子宫内膜DC表达CCL17和CCL22的水平，探讨DC在母胎免疫耐受中可能作用机制。母胎免疫耐受机制的阐明不仅对于免疫因素导致的复发性流产等病理妊娠的诊治具有重要意义，对于肿瘤免疫、移植免疫等领域的研究也具有启发作用。
研究目的:
1.建立成熟、完善的蜕膜及子宫内膜DC体外培养体系。
2.检测正常早孕、正常未孕和URSA流产者蜕膜或子宫内膜DC是否表达CCL17、CCL22，分析是否存在表达差异，探讨DC在母胎免疫耐受机制中的可能作用以及与URSA的关系。
材料和方法:
1.研究对象
1.1正常早孕组：选择2008年7月至2009年4月在我院就诊的正常早孕、要求人工流产的妇女为正常早孕组(孕周<14周)，年龄27-37岁，既往无自然流产、死胎、死产史，无染色体畸形、内分泌紊乱、生殖道感染病史，均否认自身免疫性疾病史。有正常足月分娩一次或以上。本次妊娠期间无腹痛、阴道流血等先兆流产的表现，B超提示胚胎与孕周相符，见心管搏动。
1.2正常未孕组：选取同期在我院就诊，因子宫肌瘤行腹式子宫切除术患者为正常未孕组，且手术时为月经干净3-7天。年龄35-42岁，既往有妊娠史，无自然流产、死胎、死产史，均排除自身免疫性疾病史。
1.3 URSA流产组：选取同期在我院就诊的完全符合URSA诊断标准，就诊时为妊娠早期流产(孕周<14周)，B超提示胚胎无心管搏动。年龄27-37岁，曾连续两次和两次以上早孕自然流产(孕周<14周)。
三组均于纳入研究前3个月未经任何免疫治疗和接种。
2.实验方法
2.1蜕膜或子宫内膜单个核细胞的分离，体外DC诱导培养及鉴定
无菌状态下，正常早孕组于人流取蜕膜，正常未孕组于腹式子宫切除时取子宫内膜，URSA流产组于清宫时取蜕膜，所取标本按Ⅳ型胶原酶/DNA酶Ⅰ消化和密度梯度离心法分离单个核细胞，分离后的单个核细胞用RPMI1640完全培养基(含10％FBS，2mML—谷氨酰胺，100U/ml青霉素和链霉素)悬浮，6孔板贴壁2小时，吸弃未贴壁的细胞，再每孔加入2ml RPMI1640完全培养基和细胞因子GM—CSF、IL—4(终浓度均为20ng/ml)，于第3、5、7天半量换液，同时加入细胞因子GM—CSF、IL—4(终浓度均为20ng/ml)，第10天收集细胞行流式细胞术鉴定细胞及其纯度。
2.2三组标本DC CCL17和CCL22表达水平的测定
2.2.1 real—timePCR检测三组DC CCL17和CCL22mRNA的表达
按上述方法诱导培养DC，于第十天收集三组DC。依照Invitrogen公司提供的操作步骤提取总RNA，由广州中山达安生物有限公司设计CCL17、CCL22及H—B—ACTIN引物，按Invitrogen公司提供CCL17和CCL22二步法real—time—PCR试剂盒操作步骤检测CCL17和CCL22的mRNA水平，实验重复3次。
2.2.2 ELISA法检测三组DC上清液中CCL17、CCL22的蛋白表达
按上述方法诱导培养DC，于第十天收集三组DC。再用RPMI1640完全培养基悬浮，细胞密度为2×105，24孔板培养，每孔600μl，培养12h、24h、48h、72h、96h后收集上清液，期间不换液。收集的上清液，—20℃冻存备用。待样品收集齐后，按Invitrogen公司提供ELISA试剂盒操作步骤检测DC培养上清液中CCL17、CCL22蛋白水平。每次设2个复孔，重复实验2次。
实验结果:
1.蜕膜或子宫内膜单个核细胞分离、体外DC诱导培养及鉴定
对三组分离的单个核细胞进行精确计数，每克蜕膜、子宫内膜获得单个核细胞约1×106个，经诱导培养，收集的DC约(1-2)×105个。分离的单个核细胞用6孔板贴壁2h后见圆形贴壁细胞，经rhGM—CSF联合IL—4诱导，倒置显微镜观察显示：贴壁细胞形成小的集落，逐渐悬浮，第十天形成少许突起，以单个悬浮为主，细胞仍呈现小而圆、表面突起少等未成熟DC的形态特征，培养过程中夹杂有少许细长梭状巨噬细胞生长。第十天轻轻吸取悬浮细胞，将细胞悬液依照FITC—HLA—DR，PE—Lin小鼠抗人抗体顺序标记，通过孵育等处理后，流式细胞术检测DC，其纯度>80％。
2.三组标本DC CCL17和CCL22的表达
2.1 real—timePCR检测三组DC CCL17和CCL22mRNA的表达
于第十天收集三组诱导培养的DC。结果显示：DC同时转录CCL17和CCL22，正常早孕组两者表达水平均显著高于正常未孕组(P<0.01)，URSA流产组与正常未孕组比较显著差异(P>0.05)，但URSA流产组与正常早孕组有显著差异(P<0.01)。三组标本检测结果均显示CCL17转录水平高于CCL22。
2.2 ELISA法检测三组DC上清液中CCL17、CCL22蛋白的表达
于第十天收集三组诱导培养的DC，再经短暂体外培养。结果显示：正常早孕DC能够持续旺盛分泌趋化因子CCL17和CCL22。同一时间点DC分泌的CCL17和CCL22正常早孕组显著高于正常未孕组和URSA流产组(均P<0.01)，且URSA流产患者较正常未孕明显高(除72h点P<0.05，其余均P<0.01)。同组间DC分泌的CCL17和CCL22均无统计学差异(均P>0.05)。总体上DC分泌CCL17高于CCL22。
结论:
1.体外蜕膜或子宫内膜单核细胞经GM—CSF联合IL—4培养可以成功诱导DC。
2.正常妊娠后DC表达CCL17、CCL22增强，DC可能通过高表达CCL17、CCL22对CD4+CD25+T细胞趋化作用增强，从而在母胎界面的免疫耐受中发挥调控作用。其表达CCL17、CCL22的能力降低可能与URSA流产的发病有关。